• Via un conseil génétique :

• Analyse du contexte clinique grave ou modéré

• Grossesse ? un diagnostic prénatal peut être proposé

• Prescription pour rechercher des mutations courantes CFTR ou rares, familiales si connues

• Une fois les mutations trouvées :

• Une étude familiale est toujours proposée

• Vérification des mutations trouvées chez le propositus (atteint) avec une étude parentale (si possible)

étude de ségrégation familiale

• En laboratoire de Biologie moléculaire (avec agréments en Dépistage prénatal (DPN)) :

• Extraction de l’ADN à partir de sang le plus souvent

• Amplification génique de différents exons du gène CFTR par PCR (polymérase chain reaction)

• Analyse biomoléculaire d’une trentaine de mutations courantes (couvertures d’environ 85% du gène CFTR

• Analyse moléculaire de mutations rares (plus longue)

IV) Techniques moléculaires du gène cftr :

• Techniques moléculaire mutations courantes :

• Ligation d’oligonucléotiques (OLA)  analyse des fragments

• Hybridation reverse

• Amplification spécifique d’allèles (ARMS)  gel d’agarose

Chaque pic dans une zone grise correspond à l’intervention normale du gène. Si il y a une mutation, on a par exemple le F508 normale et en rose uniquement le F508 délété

Si on a 30 fragments (30 pics) on a 30 PCR de 30 zones à risque tout de suite balayées par le séquenceur qui reconnaît l’allèle normale ou muté.

• Techniques moléculaires mutations rares :

• DHPLC

• DGGE (électrophorèse en gradient d’agents dénaturant)

• Recherche de remaniements par PCR multiplex fluorescente

• Puces (micro-arrays)

• …

On a 4 pics, 4 colonnes, les bandes s’allument en fonction de l’allèle normale ou anormal

Cela se fait sur électrophorèse, on le fait pour le dépistage néonatal.

5. Nature des mutations cf

• Mutation non sens :

• G 542X (codon stop) : origine phénicienne

• W1282 X : origine ashkénaze

• Mutations faux sens :

• N1303K : origine celte

• G551D : origine ibère

• Mutation d’épissage :

• 1717-1G > A

• Délétion : F508L

• La plus fréquente dans le monde, avec un gradient décroissant entre le Nord (87%) et le Sud (Turquie 30%)

• Origine caucasienne

• Insertion : 435 insA

Del ou ins  décalage de la phase de lecture (POL ou ORF-Open Reading Frame-)

• Grands réarrangements…

Il y a des bornes 5’ et en 3’, si l’excision est bien faite , on a un raboutage entre les exons Si il y a une mutation sur un site d’épissage , on a des raccords entre le mauvais exons , on peut même perdre un exon . Sur le 1717^e nucléotide, -1 après le G devient A, sur le 1811^e nucléotides, +1 le G devient C

Fréquence des mutations CF (vraiment intéressant..)

• G542X : environ 3% (1 à 6,6%)

• N1303K : environ 2% (0,75% à 4,5%)

• 1717-1G>A : environ 1,5% (0 à 2,7%)

• 2789+5G>A : environ 1% (0 à 2,8%)

• 9 autres mutations ont une fréquence > 0,4% :

G551D, W1282X, R553X, I507del, 2183 AA>G, 1078 delT, 711+1G>T, R1162X, Y1092X

Classification des mutations par régions CFTR

• NBF 1 :

• Exon 10 : F508 del

• Exon 11 : G542X, R553X, G551D, 1717-1G>A

 exons 10/11 représente 75% des mutations en France

• NBF 2

• Exon 19 : R1162X

• Exon 20 : W1282X

• Exon 21 : N1303K

• TM 1 :

• Exon 4 : R117H, 621+1G>T

• TM 2 :

• Intron 14b : 2789+5G>A

Si on a un défaut majeur, on n’aura jamais de production protéique suffisante. La protéine est morte née et les chlorures ne sortent pas de la membrane plasmique

• Classe I : défaut de production protéique avec un codon stop => pas de protéine ou protéine tronquée, elle est détruite

• Classe II : défaut de maturation ; les protéines sont détruites aussi dans les lysosomes

• Classe III : défaut de régulation, de conduction ; régulation des chlorure très limités, l’ATP a du mal à accroché le NBF

• Classe IV : défaut de conduction, la protéines a réussi à être synthétisée, elle a été envoyée dans la membrane plasmique mais le canal ne marche pas bien. Cependant il y a suffisamment de chlorure pour vivre.

Il faut un minimum de protéines correctes pour pouvoir vivre d’ou la thérapie génique (cf. après)

Répartition française des mutations et génotypes :

• 5 génotypes environ 58% des cas CF en France :

• F508del / F508del : 47,8%

• F508del / G542X : 3,4%

• F508del / N1303K : 2,7%

• F508del / 1717-1G>A : 2,1%

• F508del / 2789+5G>A : 1,5%

Corrélations des génotypes-phénotypes :

• Mutations S (sévères) et M (modérées)

• Génotype S/S = phénotype S

• Génotype M/M = phénotype M

• Génotype S/M = phénotype M

• Ces corrélations génotypes/phénotypes :

• Sont plus évidentes au niveau du statut pancréatique que pulmonaire

• Influence donc d’autres facteurs génétiques (CF « modifiers ») et environnementaux

Donc les personnes muco ont besoin d’un environnement très sain : pas de tabac, de contact avec les gens grippaux ou les autres muco (pas de colo entre les muco)

Corrélation génotype-phénotype et transcription :

En fonction des anomalies génétiques, l’évaluation des taux de transcrits CFTR normaux persistants dans les tissus permet de mieux comprendre la diversité des phénotypes.

Il n’y a pas de corrélation absolue génotypes/phénotypes mais il y a une corrélation raisonnable entre le % résiduel de la fonction CFTR normale et l’atteinte des différents organes.

Les taux de transcrits CFTR suivants peuvent correspondre à différentes symptomatologiques :

• Les taux de transcrits CFTR suivant corresponde à différentes symptomatologie

  • Entre 50% et 100% => aucune symptomatologie

  • 10% à 50% => stérilité masculine (CBAVD)

  • < 5% => test de sueur anormale

  • 3-4% => apparition d’une maladie pulmonaire

  • <1% => Ajout d’une insuffisance pancréatique

On revient à l’importance de la thérapie génique, si on arrive à rajouter environ 5% de protéine normales, les patients restent en vie. Il faut ajouter un minimum de protéines normales pour restaurer la fonction pancréatique.

On ne peut restaurer des capacités pulmonaires normales à un enfant qui a déjà des poumons en carton. L’espoir de la TG se fait donc chez les jeunes personnes qui n’ont pas les poumons trop abimés