3. Понятие о культурах тканей. Виды культур тканей.
Применение культур тканей в вирусологической практике дало возможность вести диагностические исследования без использования дорогостоящих лабораторных и естественно восприимчивых животных.
Культуру ткани можно получить практически из любого органа животных, человека или птиц, лучше для получения культур ткани брать ткань молодого организма и даже эмбриональную, т. к. клетки таких организмов более способны к размножению.
Культуры ткани представляют собой участки клеточного роста, находятся в специальной питательной среде вне организма in vitro. Цель, применения культур тканей:
1. Выделить возбудителя из пат. материала;
2. Наработать вакцины;
3. Поддержать вирус в условиях лаборатории;
4. Титрование вирусов;
5. Биологическая модель для постановки реакции нейтоализации и гемадсорбции;
6. Изучение процесса взаимодействия вирусов с клеткой Требования, предъявляемые культурам тканей:
1. Стерильность.
Вся работа по приготовлению культур тканей проводится только в стерильных условиях бокса.
2. Посуда.
Посуду желательно применять из нейтрального стекла и мыть ее необходимо с применением нейтральных моющих средств, она должна быть идеально чистой. Хранить посуду для приготовления культур тканей нужно отдельно от другой посуды и применять ее только для работы с культурами тканей. Пробки применяют резиновые, которые также должны быть хорошо вымыты и стерильные. Инструменты (ножницы, пинцеты, скальпели и др.), применяемые для приготовления культур тканей, после стерилизации кипячением хранят в спирте.
3. Для выращивания культур клеток используют специальные питательных среды (ростовые и поддерживающие).
В качестве питательной среды для роста клеток (ростовой) применяют различные растворы (среда Игла, 199, гидролизат лактальбумина и др.), но обязательно с добавлением сыворотки крови. В состав поддерживающей среды сыворотку не добавляют. Для контроля за изменением рН ростовой и
поддерживающей сред в процессе роста клеток в них вносят индикатор феноловый красный (фенолрот).
Для отмывания тканей от кровяных элементов, приготовления разведения трипсина используют фосфатные буферные растворы различного состава и раствор Хенкса, включающий в состав 8 солей и глюкозу.
Все существующие и применяемые в вирусологической практике в настоящее время культуры тканей можно разделить на следующие виды:
Культуры тканей
Переживающие Растущие
Плазменные Монослойные:
а) первично-
трипсинизированные
б) субкультуры
в) диплоидные
г) перевиваемые
Переживающие культуры тканей - это такие культуры тканей, у которых отсутствует пролиферация, т. е. рост и размножение клеток, но жизнеспособность клеток при этом сохраняется.
Измельченные кусочки отмывают от форменных элементов крови и помещают в специальную питательную среду в стерильную посуду и инкубируют при 37° С. Фактически эти кусочки находятся во взвешенном состоянии в питательной среде, что достигается легким перемешиванием среды. Переживающие культуры тканей применяются для приготовления некоторых вакцин в промышленных условиях. Так, например, готовят противоящурную вакцину на переживающей культуре ткани из эпителия языка КРС. Для других целей эти культуры тканей практически мало пригодны и не применяются.
Культуры растущих клеток. Это такие культуры тканей, в которых клетки пролиферируют, т. е. делятся и размножаются. После заражения таких культур вирусом в них хорошо видно действие вируса на клетки в виде специфической дегенерации пораженных клеток. К культурам растущих клеток относят плазменные культуры ' и однослойные культуры тканей.
Плазменные культуры тканей (культуры фиксированных кусочков ткаии). Кусочки какого-либо органа, величиной до 1 мм, тщательно измельчают затем отмывают фосфатно-буферным раствором (ФБР) от форменных элементов крови. Затем в стерильную посуду (пробирки, флаконы, матрацы и др.) вносят несколько мл плазмы крови кур и распределяют равномерным слоем по стенке или дну. В плазму на определенном расстоянии друг от друга помещают измельченные и отмытые кусочки ткани. Для свертывания плазмы вносят экстракт из эмбрионов кур. После свертывания плазмы кусочки прочно фиксируются на стенке посуды.
Фиксировать кусочки ткани можно помимо плазмы предварительным нагреванием стенки флакона до 45° С . Кусочки ткани прикрепляются к нагретой стенке, после чего во флаконы вносят соответствующую питательную среду, закрывают резиновыми пробками и ставят в термостат для роста клеток при температуре 37° С. От кусочков начинают расти в сторону клетки; что видно под микроскопом при малом увеличении (вид паучков). Питательную среду заменяют в зависимости от скорости роста клеток. При заражении такой культуры вирусом можно видеть действие вируса на клетки.
Однослойные (монослойные) культуры тканей.
Это такие культуры, в которых клетки пролиферируют, т. е. растут и размножаются и образуют в результате этого на стенках пробирки или матраца сплошной клеточный пласт в один слой клеток.
В основе метода лежит обработка измельченных и отмытых от форменных элементов крови кусочков тканей протеолитическими ферментами (трипсин, панкреатин, коллагеназа и др.) с целью получения взвеси отдельных клеток. Разъединение клеток происходит за счет разрушения ферментами межклеточных протоплазматических мостиков.
Однослойные культуры тканей делятся на следующие виды: