Сучасні репродуктивні технології
Допоміжні репродуктивні технології охоплюють широкий спектр методик:
1) стандартну процедуру запліднення in vitro (ЗІВ) з перенесенням ембріонів у порожнину матки;
2) перенесення гамет, зигот та ембріонів у маткові труби;
3) мікроманіпуляції на гаметах для лікування чоловічої безплідності (інтрацитоплазматична ін’єкція спермія – ІЦІС, часткове розсікання блискучої зони – ЧРБЗ, уведення спермія під блискучу зону яйцеклітини, допоміжний хетчинг, біопсія еластомерів та полярних тіл, перенесення ядер соматичних клітин);
4) допоміжні методи репродукції із застосуванням донорських яйцеклітин та ембріонів;
5) сурогатне материнство;
6) кріоконсервування сперміїв, ооцитів та ембріонів;
7) штучна інсемінація спермою чоловіка- ІСЧ або донора – ІСД.
Обстеження перед застосуванням будь-якої технології має включати вивчення анамнезу, комплексне гінекологічне дослідження, кольпоскопію та цитологічне дослідження, аналіз виділень з піхви та каналу шийки матки, бактеріологічне дослідження виділень, обстеження на інфекції, які передаються статевим шляхом, флюорографію, УЗД органів малого таза, метросальпінгографію, комплексне гормональне дослідження (пролактин, ФСГ, ЛГ, тестостерон, естрадіол, кортизон, гормони щитоподібної залози та інші за потреби), графік базальної температури за останніх 2 – 3 цикли, імунологічне дослідження (за потреби – тест контакту сперми із шийковим слизом, MAR – тест прямий і непрямий, дослідження антиспермальних антитіл тощо), висновок терапевта про можливість виношування вагітності. Також проводять рентген дослідження ділянки турецького сідла (при підвищеному рівні пролактину для виключення пролактинсекретуючої пухлини гіпофіза). До методів обстеження за показаннями відносять ендоскопічні методи (лапароскопію та гістероскопію), які проводять як з лікувальною , так і з діагностичною метою. Обов’язкове комплексне обстеження партнера, яке включає повторне вивчення сперми в динаміці, обстеження на інфекції, які передаються статевим шляхом, флюорографію, консультацію андролога та ін.
Штучна інсемінація
Штучна інсемінація – найпоширеніший метод допоміжної репродукції, інструментальне введення сперми в піхву, шийку матки, порожнину матки. Застосовують переважно внутрішньоматкову інсемінацію – ВМІ.
Розрізняють гомологічну штучну інсемінацію з використанням сперми чоловіка (ІСЧ) і гетеро логічну із застосуванням сперми донора (ІСД).
ІСЧ показана при гіпоспадії сечівника, імпотенції, відсутності еяколяції, олігоспермії зі збереженою нормальною рухливістю сперміїв, вагінізмі й аномаліях розвитку піхви, а також для пригнічення імунологічної агресії слизу каналу шийки матки. Ефективність становить 14 – 20 % на одну спробу. Для ІСЧ може бути використована нативна або кріоконсервована сперма чоловіка.
З метою підвищити ефективність ВМІ у лікувальних циклах здійснюють стимуляцію овуляції для отримання 1 – 3 передовуляторних фолікулів, використовуючи антиестрогени (кломіфенцитрат, кломіфен, клостилбегіт) як самостійно, так і в поєднанні з препаратами ФСГ (гонал-Ф, пурегон, фостимон, менопур). Стимуляцію здебільшого розпочинають з уведення 50 – 100 мг (до 150 мг) клостилбегіту на добу з 5-го по 9-й день циклу або препарату ФСГ по 75 МО на добу. Як тригер овуляції використовують людський хоріонічний гонадотропін (прегніл, овітрел) за розмірів передовуляторного фолікула 20 – 24 мм і товщини ендометрія не менше ніж 9 мм.
Процедуру ВМІ переважно виконують двічі протягом одного лікувального циклу – перед овуляцією та після неї. У процесі індукції овуляції обов’язково проводять клінічне, ультразвукове та гормональне обстеження пацієнтки.
При ІСЧ у порожнину матки вводять не весь еякулят, а лише виділену фракцію активно рухливих сперміїв. Найбільшого поширення набула методика «swim-up » (флотації або спливання), що ґрунтується на здатності активно рухливих сперміїв спливати в культуральне середовище після центрифугування. Також застосовують метод центрифугування в градієнтах щільності (Supra Sperm System, Medicult; isolate, Irvine Scientific). Для підготовки сперми до інсемінації доцільно використовувати спеціалізовані культуральні середовища, розроблені за результатами дослідження складу фолікулярної і перитонеальної рідини та вмісту маткових труб (SpermCare, CCDLab; Sperm Preparation Medium for IUI, Medicult). Ці середовища містять необхідні мікро- та мікроелементи, антибіотики, буферні системи, мають відповідну осмолярність та рН, пройшли тестування на ембріотоксичність.
Після овуляції за потреби виконують підтримку лютеїнової фази (дуфастон 10 – 30 мг на добу або утрожестан 100 – 200 мг на добу) під контролем базальної температури. У разі настання вагітності терапію продовжують.
ІСД (інсемінація спермою донора) здійснюють за медичними показаннями: олігоастеноспермія ІІІ ступеня або азооспермія (відсутність сперміїв в еякуляті), спадкові хвороби з високою ймовірністю народження хворої дитини (консультування генетика). На сьогодні технологія ІЦІС (інтрацитоплазматична ін’єкція сперміїв) при тяжких порушеннях сперматогенезу дає змогу уникнути ІСД, яка не завжди є прийнятною для подружніх пар з погляду моралі або в силу релігійних особливостей.
Методика проведення ІСД не відрізняється від ІСЧ. ІСД завжди виконують із використанням кріоконсервованої сперми у зв’язку з необхідністю ретельного та тривалого обстеження донора, регламентованого європейськими вимогами до створення кріобанків. Протягом 6 міс. донорський матеріал має зберігатися в карантинному сховищі до отримання результатів повторних обстежень донора. Перший на території країн СНД кріобанк було створено в Харкові в Інституті проблем кріобіології та кріомедицини НАН України під керівництвом академіка В. І. Грищенка.
Метод штучної інсемінації і до сьогодні не втратив своєї актуальності в усьому світі. За відсутності ефекту ІСЧ проводять повторно (усього 6 циклів), однак надалі слід переходити до лікування методом ЗІВ (запліднення in vitro).
Запліднення in vitro
До середини 70-х років ХХ століття склалися усі передумови для практичної реалізації ідеї лікування безплідності методом ЗІВ: розуміння ендокринних механізмів регуляції репродуктивного циклу, процесів дозрівання яйцеклітини та імплантації ембріонів, механізмів впливу на них фармацевтичними препаратами, напрацювання методів дослідження сперми та її підготовки для штучної інсемінації, розробка обладнання, середовищ і умов культивування гамет та ембріонів in vitro.
Народження першої дитини, зачатої in vitro (25 липня 1978 року, Steptoe, Edwards), відкрило нову епоху в лікуванні безплідності – епоху принципово нових технологій допоміжної репродукції. В Україні першу успішну спробу застосування технологій ЗІВ було зроблено в Лабораторії кріобіології системи репродукції людини Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України (м. Харків). У 1991 році народилася перша в Україні дитина зачата за методом ЗІВ.
На сьогодні програма ЗІВ набула значного поширення в усьому світі. Частота настання вагітності при лікуванні безплідності методом ЗІВ у різних клініках досягає в середньому 20 – 35 % у розрахунку на одне перенесення ембріонів.
Показання до ЗІВ:
1) жіноча безплідність:
а) абсолютна трубна безплідність (відсутність маткових труб або їхня непрохідність);
б) безплідність , зумовлена ендометріозом (за відсутності ефекту від медикаментозної терапії);
в) ендокринна безплідність за відсутності ефекту від інших методів лікування;
г) безплідність нез’ясованого ґенезу за відсутності ефекту від ІСЧ (протягом 6 циклів);
д) безплідність, зумовлена цервікальним фактором, за умови відсутності ефекту від лікування методом ІСЧ (протягом 6 циклів);
е) безплідність, зумовлена відсутністю або функціональною неповноцінністю яєчників чи матки, у цьому разі програма ЗІВ буде включати використання донорських яйцеклітин, ембріонів або програму сурогатного материнства;
2) чоловіча безплідність (олігоастенотератоспермія І – ІІ ступеня за умови неможливості проведення або неефективності ІСЧ).
Першим етапом програми ЗІВ є контрольована суперовуляція (КСО), мета якої – запобігання атрезії більшості фолікулів і одержання кількох, здатних до запліднення яйцеклітин. У разі перенесення в порожнину матки кількох ембріонів імовірність імплантації вища, ніж при перенесенні одного ембріона.
Для КСО здебільшого використовують препарати рекомбінованого або високо очищеного ФСГ (гонал-Ф, пурегон,фостимон,менопур, Serono, Organon, AMSA, Ferring). На сьогодні «золотим стандартом» вважається використання препаратів ФСГ у комплексі з такими антагоністами гонадотропного рилізинг-гормону (ангнРГ), як диферелін, бусерин, Фарм-Синтез, Beafour Ipsen.
Дія цих препаратів аналогічна дії рилізинг-гормону гіпоталамуса. Зв’язування їх із рецепторами гіпофіза спричинює короткочасне підвищення секреції власного ФСГ (ефект спалаху, flare-up), після чого настає стійка десенситизація (нечутливість) гіпофіза внаслідок перенасичення рецепторів. Клінічно цей ефект проявляється у вигляді короткочасної оборотної медикаментозної кастрації. Переважно використовують аГнРГ (агоністи) завдяки їхній здатності запобігати передчасному підвищенню рівня ЛГ і зберігати базальний рівень ендогенного ЛГ зниженим, що забезпечує лікувальному циклу більшу керованість і прогнозованість. На сьогодні розроблено відносно нову групу анГнРГ – цетротид, оргалутран, Serono, Organon, які зумовлюють десенситизацію без початкового стимулювального ефекту. Додатково, залежно від показань і досвіду попередніх лікувальних циклів, призначають бромкриптин, кортизол, L-тироксин, мультивітамінні комплекси, ацетилсаліцилову кислоту тощо. У разі дефіциту власного ЛГ до протоколу КСО включають рекомбінований ЛГ (люверис, Serono).
Протокол стимуляції із застосуванням лише препаратів ФСГ та ХГ отримав назву «чистої» схеми КСО. З 2-го по 12-й день менструального циклу щоденно ФСГ 75 – 225 МО, на 13-й день ХГ. У процесі використання «чистої схеми нерідко доводиться переривати лікувальний цикл у програмі ЗІВ у зв’язку з передчасним ендогенним піком вмісту ЛГ, який спостерігається приблизно у третини пацієнток і призводить до лютеїнізації передовуляторних фолікулів та дегенерації яйцеклітини. Нині цю схему практично не використовують.
«Короткий» протокол КСО із застосуванням аГнРГ обирають переважно для запліднення пацієнток зі зниженим оваріальним резервом. Агоніст ГнРГ щоденно з1-го по 12-й день менструального циклу, ФСГ щоденно 75 – 225 МО з 2-го по12-й день, на 13-й день ХГ.
«Тривалий» протокол КСО із застосуванням аГнРГ ефективний при заплідненні пацієнток з помірним і високим оваріальним резервом за винятком хворих з низькою реакцією яєчників на стимуляцію. Агоніст ГнРГ щоденно з 21-го дня менструального циклу і продовжують лікування щоденно по12-й день наступного менструального циклу , ФСГ щоденно 75 – 225 МО з 2-го по12-й день цього циклу, ХГ на 13-й день. Не рекомендують застосовувати цей протокол при схильності до полікістозу яєчників у зв’язку з високим ризиком розвитку тяжкого синдрому гіперстимуляції яєчників.
Протоколи з використанням антагоністів ГнРГ мають певні переваги перед застосуванням аГнРГ (протокол КСО з використанням депо-форми анГнРГ – ФСГ щоденно 75 – 225 МО з 2-го по 12-й день менструального циклу, анГнРГ одноразово 3 мг на 7-й день, ХГ на 13-й день; протокол КСО зі щоденним уведенням анГнРГ – ФСГ щоденно 75 – 225 МО з 2-го по 12-й день циклу, антагоніст ГнРГ 0,25 мг щоденно з 6-го по 13-й день, ХГ на 13-й день.) : сумарна доза ФСГ на один лікувальний цикл знижується на 30 % (зниження вартості лікування), відсутній ефект початкової стимуляції (спалаху), що запобігає утворенню кіст яєчників, нижча частота розвитку синдрому гіперстимуляції яєчників (особливо актуально для пацієнток із синдромом полікістозних яєчників), зменшення тривалості лікувального циклу (у 2 – 2,5 разу порівняно з «тривалою» схемою з аГнРГ), у разі ненастання вагітності гормональний гомеостаз пацієнтки відновлюється значно швидше, ніж при використанні аГнРГ.
Слід зазначити, що у процесі стимуляції суперовуляції слід постійно спостерігати за змінами в яєчниках пацієнтки та її ендокринному статусі, оскільки сама по собі КСОє досить серйозним втручанням у нейроендокринні процеси, що відбуваються в організмі жінки. Крім того, організм кожної жінки по-різному реагує на стимуляцію. Зручним з погляду практики параметром, на підставі якого можна заздалегідь оцінити ефект стимуляції яєчників, та ймовірність настання вагітності, є визначення базального рівня ФСГ і ЛГ на 2 – 3-й день менструального циклу (поза стимуляцією).
Ультразвукове дослідження органів малого таза є одним з найважливіших методів обстеження у процесі клінічного спостереження за пацієнткою при КСО. Для об’єктивної оцінки стану пацієнтки також проводять гормональний моніторинг (естрадіол у першу фазу лікування, естрадіол та прогестерон – у другу фазу). У нормі кількість зрілих фолікулів має корелювати з рівнем естрадіолу. З іншого боку, значення цього показника перед пункцією понад 4000 пг/мл свідчить про небезпеку розвитку синдрому гіперстимуляції яєчників тяжкого ступеня. У цьому разі потрібно утриматися від уведення овуляторної дози ХГ або взагалі відмінити його, а також відмовитись від підтримувальної терапії лютеїнової фази людським ХГ.
На завершальному етапі стимуляції суперовуляції призначають ХГ в овуляторній дозі (прегніл, Органон, овітрел,Сероно), імітуючи природний пік рівня ЛГ в організмі жінки. Критерії готовності пацієнтки до призначення овуляторної дози ХГ:
1) за даними УЗ-моніторингу: діаметр фолікула-лідера – 17 – 18 мм; наявність додаткових двох фолікулів або більше діаметром 14 мм; товщина ендометрія – 8 мм;
2) за даними гормонального моніторингу: рівень естрадіолу в плазмі крові – 100 – 150 пг/мл на кожний великий фолікул.
За наявності вищевказаних ознак пацієнтці ввводять тригерну дозу ХГ (5000 – 10 000 ОД).
Через 34 – 36 год після введення ХГ під УЗ-контролем виконують пункцію фолікулів та аспірацію яйцеклітин. Пункцію здійснюють в асептичних умовах під короткочасним наркозом переважно трансвагінальним доступом. Під контролем трансвагінального УЗ-датчика проколюють стінку піхви, потім яєчника, аспірують вміст фолікулів у стерильні теплі пробірки та передають ембріологам.
Безпосередньо після цього яйцеклітини переносять у чисте середовище для культивування, оцінюють ступінь їх зрілості і морфологію. На підставі результатів оцінювання ооцити культивують від 4 до 6 год. Потім проводять інсемінацію зрозрахунку 50 000 – 100 000 сперміїв на одну яйцеклітину. Для підготовки сперміїв використовують методику “swim-up”, або метод центрифугування в градієнтах щильності (SupraSperm System, Medicult; IsoLate, Irvine Scientific). Яйцеклітини й ембріони культивують в умовах інкубатора за температури 37 оС, вмісту СО2 5 % і вологості повітря 80 – 95 %. Такі умови необхідні для функціонування буферних систем культуральних середовищ і нормального розвитку ембріонів. Усі середовища та лабораторний посуд мають відповідати стандартам ембріологічної лабораторії.