Цитологический анализ отпечатков раневой поверхности у лошадей
Этот метод был впервые предложен Покровской и Макаровым.
Систематические исследования отпечатков отражают реактивные, иммунобиологические силы организма и регенеративно-восстановительные процессы в ране. Метод отпечатков позволяет судить о напряженности борьбы организма с инфекцией и о динамике очищения ран от микробов и некротических тканей. Цитологический анализ отпечатков помогает установить фазу раневого процесса и может быть использован для оценки хирургического вмешательства и успешности медикаментозного лечения.
Ценность метода отпечатков раневой поверхности заключается и в том, что их берут непосредственно с поверхности раны; поэтому, наряду с клетками раневого экссудата, находят клетки образующейся грануляционной ткани.
Техника. Перед изготовлением отпечатка осторожно удаляют с поверхности раны стерильным марлевым компрессом, овлажненным изотоническим раствором хлорида натрия, раневой экссудат (сухой тампон, даже при легком прикосновении, нередко травмирует грануляционную ткань, особенно в первые дни после ее образования). Затем прикосновением к поверхности раны стерильного и обезжиренного в спирт-эфире стекла наносят отпечаток на последнее. При этом не допускают грубого надавливания на стекло и скользящих движений, так как в противном случае клетки сильно деформируются.
С одного и того же участка раны последовательно берут 4—5 отпечатков. В первом отпечатке преобладают клетки раневого экссудата и гнойный детрит. В последующие отпечатки, особенно в последние два, попадают клетки и микробы, находящиеся непосредственно на раневой поверхности, в том числе клетки пролиферата (поверхностного слоя грануляционной ткани), имеющие наибольшее диагностическое значение.
Отпечатки следует брать с нескольких участков раны, так как регенеративные процессы и распределение клеток по раневой поверхности неравномерны, а иногда весьма различны.
Полученные отпечатки необходимо быстро подсушить на воздухе и зафиксировать в этиловом или метиловом алкоголе в течение 5 минут или в спирте-эфире -— 15 минут, затем на обратной стороне стекла отметить восковым карандашом дату и номер истории болезни. Фиксированные отпечатки, так же как и мазки крови, окрашивают по Романовскому — Гимза. Отпечатки с поверхности свежих ран следует красить в течение 45—60 минут, а с поверхности гранулирующих ран — 1 —1 /2 часа
Каждый отпечаток изучают под микроскопом.
Клетки раневой поверхности у лошади. В опечатках раневой поверхности обнаруживают клетки вазогенного и гистогенного происхождения. Клетки вазогенного происхождения (нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты и моноциты) появляются на раневой поверхности и в раневом экссудате первыми.
Нейтрофилы, не подвергшиеся дегенеративным изменениям, морфологически вполне сходны с нейтрофилами крови. В отпечатках встречаются зрелые и (редко) юные формы.
Наличие в ране микробов, изменение ионного равновесия, появление осмотической гипертонии и ряд других факторов ведут к глубоким дегенеративным изменениям нейтрофилов. Клетки набухают, в протоплазме появляются вакуоли, в ядрах обнаруживают гиперхроматоз, кариопикноз и кариорексис. При тяжелом раневом процессе наблюдается массовое расплавление и распад клеток, появление в препарате большого количества глыбок хроматина различной величины.
При благоприятном развитии раневого процесса и удовлетворительном общем состоянии организма микробы полностью поглощаются нейтрофилами и имеют различную по интенсивности окраску, что указывает на активный фаголиз микробов и высокую реактивную способность организма.
При недостатке защитных реакций организма и высокой вирулентности микробов фагоцитоз протекает вяло, а фаголиз слабо выражен или отсутствует. Фагированные микробы действуют на нейтрофилов токсически; эти клетки подвергаются дегенеративным изменениям или полностью разрушаются. Микробы размножаются в протоплазме клеток, разрушают ее (плазмолиз) и, освобождаясь, осеменяют окружающую среду. Такое явление указывает на угнетение иммунобиологических реакций, тяжелое общее состояние организма или служит признаком предстоящего в ближайшие дни клинического ухудшения процесса.
Иногда в отпечатках обнаруживают громадное количество микробов и в то же время замечается полное отсутствие фагоцитоза нейтрофилами. Стойкое отсутствие фагоцитарной реакции при неоднократных исследованиях является признаком ареактивности организма, несостоятельности ею защитных, иммунобиологических реакций.
Таким образом, изучение отпечатков позволяет судить о вирулентности микробов, о затухании и обострении инфекции, о реинфекции и об активности защитных реакций организма. Поэтому следует учитывать общее количество микробов в отпечатках и обращать особое внимание на активность фагоцитоза и переваривания микробов нейтрофилами. При этом полезно окрашивать часть отпечатков также по Граму.
Эозинофилы встречаются в отпечатках в небольшом количество. Эти клетки можно легко отличить от других клеток экссудата по крупной эозинофильной зернистости протоплазмы. В большинстве случаев они обнаруживаются в отпечатках из свежих ран, увеличиваются в количестве при обострениях раневого процесса.
Лимфоциты и моноциты постоянно обнаруживаются в отпечатках в небольшом количестве. В первой фазе раневого процесса их бывает несколько больше, чем во второй фазе. Морфологически они вполне сходны с лимфоцитами и моноцитами крови. Лимфоцитам присуща трефоно-образовательная функция, а моноцитами активно фагируются и перевариваются микробы, эритроциты и другие клетки.
Рис. 36. Клетки раневого экссудата у лошади:
1 — макрофаг, фагировавший полибласта; 2 — митоз ядра полибласта; 3,4 — прямое деление ядра полибласта; 5 — гигантская многоядерная клетка; 6,7 и 13 — полибласты; 11 — полибласт с азурофильной зернистостью; 14 — полибласт с вакуолями в протоплазме; 9 — превращение лимфоцита в гистиоцит; 12 — плазмоцит (лимфоцит, приобретающий активную подвижность); 8, 10 и 23 — профибробласты; 17 — моноцит в конечной фазе фагоцитоза; 15, 16—дегенернрованные макрофаги: 18. 19, 20, 21 и 22 — микрофаги (Сенькин).
Не менее важное значение в раневом процессе имеют одноядерные клетки гистиоцитарного происхождения. Несмотря на значительный полиморфизм этих клеток, все они должны быть отнесены к тканевым гистиоцитам (полибластам). Тем не менее с клинической точки зрения весьма целесообразно разделить их на группы. Отдельным группам этих клеток присуще некоторое функциональное различие, сказывающееся на их морфологии. Максимальное количество этих клеток обнаруживают в пролиферате (грануляционной ткани), и поэтому их часто находят в отпечатках раневой поверхности.
Полибласты имеют округлую, неправильно контурированную, вытянутую, полигональную или отростчатую форму. Округлое, овальное, почкообразное, иногда неправильной формы, хорошо контурированное ядро располагается эксцентрично или на периферии клетки. Ядро содержит крупные глыбки хроматина и два-три хорошо контурированных ядрышка, окрашивающихся в нежно-голубой цвет.
Протоплазма окрашивается по Романовскому — Гимза в дымчато-голубой цвет (базофилыю), часто содержит вакуоли и азурофильную зернистость в виде различных глыбок, окрашивающихся в розовый цвет. Протоплазма молодых клеток окрашивается более интенсивно. Эти клетки обладают способностью к прогрессивному развитию. В них нередко можно наблюдать прямое и непрямое (митоз) деление ядра.
Роль полибластов в раневом очаге огромна. Они, невидимому, участвуют п выработке местного тканевого иммунитета, в очищении раны от микробов и мертвых тканей и в регенеративных процессах. В протоплазме полибластов нередко замечаются вакуоли, появляющиеся в результате токсического действия среды или фагоцитоза. В последнем случае вакуоли образуются на месте переваренных клеток и содержат различные плотные включения. При наличии в рапе микробов и мертвых тканей обнаруживается в отпечатках большое количество полибластов с выраженной функцией бактериофагии и особенно цитофагии (фагирующие макрофаги). Протоплазма таких клеток принимает характерное сетчато-пенистое строение, красится базофильно, содержит вакуоли и различные плотные включения. Ядро имеет чаще неправильную форму и располагается в клетке эксцентрично. В протоплазме таких клеток содержатся различные фагированные и подвергающиеся перевариванию элементы — микробы, эритроциты, нейтрофилы, волокна фибрина. Таким образом, эти клетки принимают непосредственное участие в очищении раневого очага от микробов и мертвых тканей.
Массовое появление фагирующих полибластов в раневом очаге указывает на хорошую сопротивляемость организма инфекции и на продолжающееся очищение раневого очага от мертвых и нежизнеспособных тканей. Наличие большого количества этих клеток у тяжело больных лошадей служит признаком повышения реактивной способности ретикулоэндотелиальной системы и указывает на возможность клинического улучшения процесса в ближайшие дни.
В отпечатках с поверхности гранулирующих ран, имеющих выраженную тенденцию к рубцеванию, полибласты имеют вид вытянутых, веретенообразных или сильно отростчатых клеток. Периферическая часть протоплазмы таких клеток красится менее интенсивно. Эти клетки внешне напоминают фибробласты и носят название профибробластов (Покровская). Массовое появление в отпечатках вытянутых и отростчатых полибластов указывает на активность регенеративных процессов и рубцевание раны; последняя быстро заживает и покрывается эпидермисом.
Гигантские многоядерные клетки имеют базофильную протоплазму и отличаются от других клеток-отпечатков своей величиной и большим количеством (до 10—13 и больше) ядер. Эти клетки образуются в раневом очаге при амитотическом делении ядра полибластов без деления протоплазмы и путем слияния отдельных клеток в протоплазматический синцитий.
Гигантские многоядерные клетки обнаруживаются в отпечатках тогда, когда в ране одновременно содержится много других активных клеток ретикулоэндотелиальной системы. Это — реактивные клетки, но роль их в раневом процессе недостаточно ясна. Полагают, что они появляются в ране после применения сильных антисептиков, гипертонических растворов и при наличии инородных тел.
Плазматические клетки имеют сравнительно небольшие размеры. Края клетки хорошо контурированы; протоплазма резко базофильная (синяя). Ядро располагается эксцентрично, имеет колесовидную форму или характерное пятнистое строение в виде грубых глыбок пли полосок хроматина. В центре клетки, вблизи ядра, имеется зона просветления протоплазмы величиной с ядро. Эти клетки легко подвергаются до генеративным изменениям и распаду. Обычно плазматические клетки появляются в отпечатках медленно заживающих ран или в случаях, когда тенденция к заживлению совсем отсутствует, при наличии продуктов распада, а также в язвах с молекулярным распадом. Наличие этих клеток укалывает па безуспешность лечения, а их обилие в отпечатках — на неблагополучие раневого процесса.
Эпителиальные клетки. В отпечатках обнаруживают также клетки плоского эпителия. Они имеют характерную призматическую форму и центральное расположение ядра. Протоплазма по мере старения клетки становится все менее базофильной и у зрелых клеток почти бесцветна.
Когда отпечатки взяты вблизи эпидермизирующихся участков, бывает особенно много эпителиальных клеток. При задержке эпидермизации и распаде участков эпидермиса обнаруживают в отпечатках большое количество дегенерированных эпителиальных клеток.
Очень редко встречаются в отпечатках базофилы, тучные и другие клетки.
Динамика цитологических изменений. При благоприятном течении раневого процесса обнаруживаются в первые 2—3 дня после ранения клетки исключительно вазогенного происхождения (нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты и моноциты); ведущее место среди них занимают нейтрофилы. Подавляющее большинство нейтрофилов имеет различные дегенеративные изменения. Нейтрофилы активно фагируют и переваривают микробов. С появлением в ране островков грануляционной ткани обнаруживаются отдельные молодые, округлой формы полибласты, уменьшается количество дегенерированных нейтрофилов и микробов.
К моменту образования в ране сплошного грянуляционного барьера обнаруживают в отпечатках большое количество полибластов; местами они располагаются группами, гнездами, до 15—20 клеток в поле зрения микроскопа. Среди полибластов обнаруживают много фагирующих клеток. Выраженная бактериофагия и цитофагия у полибластов служит признаком высокой защитной реакции организма и активности процессов самоочищения раны от микроорганизмов и мертвых тканой. При этом резко уменьшается количество микробов и дегенерированных форм нейтрофилов.
К моменту полного очищения раны от микробов и мертвых тканей уменьшается в отпечатках количество фагирующих полибластов и накапливаются вытянутые и отростчатые формы. С появлением ободка эпидермиса обнаруживаются в отпечатках эпителиальные клетки.
При резком угнетении защитных функций организма и тяжелом общем состоянии организма, а также при сепсисе находят в отпечатках из ран громадное количество микробов; фагоцитоз их отсутствует или, при вялом фагоцитозе, микробы не перевариваются нейтрофилами. Все нейтрофилы или подавляющее большинство их имеют глубокие дегенеративные изменения, вплоть до полного распада клеток. Макрофаги отсутствуют. Изредка встречаются единичные полибласты с глубокими дегенеративными изменениями и выраженной токсической вакуолизацией. Сохранение такой картины отпечатков при неоднократных исследованиях указывает на срочную необходимость поднять защитные реактивные силы организма.
Появление и накопление в отпечатках полибластов, особенно фагирующих клеток, указывает на улучшение общего состояния организма и местного процесса.
Рис. 37 А, Б и В – отпечатки раневой поверхности в начале первой фазы заживления воспалившейся раны:
1 – набухание ядер; 2 – гиперхроматоз; 3 – частичный распад клеток; 4 – активный фагоцитоз и фаголиз микробов; 5 – эозинофил; 6 – кариорексис; 7 – кариопикноз. D – отпечатки раневой поверхности в конце второй фазы заживления раны (превращение полибластов в профибробласты) (Сенькин)