Тема 5: санітарно-бактерілогічний контроль виробництва
1. Завдання та об'єкти контролю. Нормативно-технічна документація та організація контролю. Загальні методи мікробіологічного контролю.
2. Виявлення окремих груп мікроорганізмів.
3. Мікробіологічні дослідження при виробництві маргарину. Відбір проб.
4.Контроль санітарно-гігієнічного стану маргаринового заводу.
1. Завдання та об'єкти контролю. Нормативно-технічна документація та організація контролю. Загальні методи мікробіологічного контролю.
Завдання та об'єкти контролю. Мікробіологічний контроль на підприємствах, що виробляють маргаринову продукцію, повинен проводитися з метою підтримки всього виробництва на високому санітарно-гігієнічному рівні, що забезпечує належну бактеріальну чистоту продукції, що випускається.
Крім цього, в завдання мікробіологічного контролю входить спостереження за процесом підготовки молока, що вводиться в рецептуру маргарину. Смак і аромат маргарину засновані на раціональному використанні мікробіологічного процесу при сквашуванні молока. У зв'язку з цим за допомогою мікробіологічного контролю повинне здійснюватися управління цим процесом з метою надання молоку, підготовленому для виробництва, належних смакових і ароматичних властивостей і накопичення вітамінів групи В, що підвищують харчову цінність маргарину, а також утворення належного редукуючого комплексу, що оберігає жирову основу від окислення. При правильному сквашуванні молока в ньому накопичується вітамін В12, а також інші вітаміни В-группи.
Мікробіологічному контролю підлягає:
1. Сировина під час надходження на підприємство, безпосередньо перед його використанням і на всіх основних етапах переробки; допоміжні матеріали; готова продукція; санітарний стан апаратури і тари.
2. Процес підготовки молока до сквашування і його сквашування. При підготовці молока до сквашування контролюють ефективність пастеризації (знищення мікрофлори, присутньої в значній кількості в молоці, що потрапляє на виробництво), технологічний режим застосування заквасок і якість сквашеного молока.
Періодично перевіряють вміст речовин, що обумовлюють аромат сквашеного молока (вміст в ньому летючих кислот і ацетоїну спільно з диацетилом).
Загальні методи мікробіологічного контролю.
Мікробіологічний контроль включає:
а) перегляд досліджуваного матеріалу під мікроскопом із застосуванням або без застосування спеціальних методів забарвлення;
б) кількісний облік мікроорганізмів шляхом підрахунку колоній, що утворилися при висіві певної кількості досліджуваного матеріалу на тверде поживне середовище;
в) визначення титру шляхом виявлення мінімальних кількостей досліджуваної речовини, в яких можна виявити присутність певних груп бактерій;
г) визначення якісного складу мікрофлори шляхом застосування вибіркових середовищ, на яких специфічно розвиваються певні бактеріальні групи.
Методи мікроскопічного дослідження. Перегляд досліджуваного матеріалу під мікроскопом є основним прийомом, необхідним при мікробіологічному дослідженні.
При проведенні мікробіологічного контролю застосовують наступні способи мікроскопування: мікроскопування живого матеріалу в краплі води або поживного середовища без забарвлення і мікроскопування матеріалу після його фіксації і фарбування.
Мікроскопіювання без забарвлення застосовують в основному для розгляду дріжджових клітин і цвілі. При приготуванні препаратів цвілі на предметне скло наносять краплю води або 50%-ного спирту, потім кладуть шматочок міцелію цвілі, розпрямляють його якомога тонше двома препарувальними голками, після чого накладають ретельно протерте покривне скло - і обережно його притискають. Цвілевий матеріал краще розглядати молодий, для чого його треба брати з краю колонії, де найбільш молоді пагони. Препарати дріжджів готують таким же чином в краплі води. Дріжджі не утворюють складних пагонів і тому не вимагають такої обережності при приготуванні препаратів, як цвілі. Цвіль і дріжджі розглядають за допомогою об'єктиву 40Х; і окуляра 7Х; що дає збільшення до 300 разів.
Приготування препаратів без забарвлення хоча і є простішим, але на практиці при дослідженні бактеріальних культур частіше роблять препарати, на яких бактеріальні клітини фіксовані на поверхні предметного скла, а потім забарвлені. На предметне скло поміщають суспензію досліджуваного матеріалу з рідкого середовища; якщо ж розглядають матеріал з посівів на твердому середовищі, то на наочне скло наносять невелику краплю води і вводять в неї петлею або голкою невелику кількість бактеріальної культури з краю бактеріальної колонії або з поверхневого росту на агаровому скосі.
Препарат висушують при кімнатній температурі або при обережному підігріванні над полум'ям. Потім препарат фіксують з метою загибелі і прилипання клітин до скла, щоб уникнути змиву при подальшому забарвленні і зробити клітини сприйнятливішими до нього.
Фіксацію проводять, проводячи препарат три-чотири рази над полум'ям пальника або опускаючи препарат на 2—3хв в спирт.
Забарвлення бактеріальних спор. У деяких бактерій, найчастіше у паличкоподібних, за несприятливих умов існування (зменшена кількість поживних речовин в середовищі, знижена вологість навколишнього субстрату, дія високих температур, несприятлива реакція середовища і т. п.) вміст клітин ущільнюється, вкривається товстою оболонкою — утворюються спори. Спори можуть зберігатися тривалий час, не втрачаючи життєздатності. Спори стійкіші до несприятливих умов зовнішнього середовища, ніж вегетативні клітини. Особливо характерною є стійкість спор до нагрівання: спори значно довше витримують нагрівання при високій температурі. Спороутворюючі грунтові палички витримують нагрівання при 80°С протягом декількох годин, а при 100°С — десять хвилин. Потрапивши в сприятливі умови, спори набухають унаслідок поглинання вологи, значно збільшуються в розмірах, оболонка спор розривається, а потім із спори проростає вегетативна клітина.
Спороутворення — стійка родова ознака певних груп мікроорганізмів. Бактеріальні спори не фарбуються при обробці препарату звичайними фарбами, в мазку серед забарвлених клітин вони виявляються як світлі включення.
Для забарвлення спор застосовують спосіб, заснований на наступному принципі: протравлюють препарат кислотою, щоб зробити оболонки спор сприйнятливішими до забарвлення, обробляють препарат сильнодіючим міцним розчином барвника, досягаючи фарбування не тільки вегетативних клітин, але і спор, обережно обезбарвлюють протоплазму вегетативних клітин, що легше віддають забарвлення, ніж спори, і додатково забарвлюють її слабким розчином барвника.
Приготування розведень. Більшість методів мікробіологічної роботи, пов'язаних з кількісним обліком мікроорганізмів в досліджуваному продукті, вимагають попереднього розведення посівного матеріалу, оскільки рясний бактеріальний ріст на поживних середовищах ускладнює кількісний підрахунок.
Для розведень застосовують водопровідну воду, розлиту по 10 мл в пробірки або по 100 мл в колби і простерилізовану. Певну кількість досліджуваного продукту, частіше за всього 1 мл або 1 г (узятого піпеткою або відваженого в стерильний бюкс або на стерильний папірець), вносять до підготовленої для розведень води і гарненько збовтують. При аналізі маргарину воду обережно підігрівають до температури не вище 40—45°С до повного розплавлення маргарину. З отриманого таким чином першого розведення беруть піпеткою 1 мл і вносять до живильних середовищ або, якщо потрібно отримати великі розведення, їх готують по наступній схемі.
Перше розведення 1: 10. 1 мл або 1 г досліджуваного матеріалу вносять до 10 мл стерильної води.
Друге розведення 1: 100. З першого розведення беруть 1 мл (що містить 0,1 мл початкової речовини) і вносять до 10 мл стерильної води.
Третє розведення 1: 1000. З другого розведення беруть 1 мл, (що містить 0,01 мл початкової речовини) і додають до 10 мл стерильної води.
Четверте розведення 1: 10 000. З третього розведення беруть 1 мл (що містить 0,001 мл основної речовини) і додають до 10 мл стерильної води.
П'яте розведення 1: 100 000. З четвертого розведення беруть 1 мл і додають до 10 мл стерильної води, — і так далі.
Розведення
Досліджувана
речовина
Мал. 18. Приготування розведень і посівів на чашки Петрі
Зазвичай роблять три розведення, наприклад 1 : 100; 1 : 1000 і 1:10000.
Для кожного подальшого розведення треба брати нову стерильну піпетку. При приготуванні розведень необхідно дотримуватися умов, що перешкоджають потраплянню сторонніх забруднень з повітря і т.д.
Посіви зазвичай починають з останнього розведення, при цьому можна користуватися однією піпеткою, оскільки посів проводять від більшого розведення до меншого.
Мал. 19. Схема пересіву при виготовленні розведень.
Допустимо скорочувати кількість розведень, що готуються, при цьому з першого розведення, що містить 1 мл або 1 г досліджуваного продукту в 10 мл води, беруть для посівів на поживні середовища 1 мл, тобто 0,1 г продукту, потім три краплі, тобто 0,01 г продукту і 1 петлю, тобто 0,001 продукту.
Підрахунок колоній на чашках Петрі. Певну кількість досліджуваного продукту, без розведення або після відповідного розведення, вносять піпеткою в стерильну чашку Петрі, яку потім заливають заздалегідь розплавленим агаром, що має температуру не вище 50°С. Для більш рівномірного розподілу клітин мікробів чашку безпосередньо після вливання в неї поживного середовища кілька разів обережно нахиляють в різні боки. Після посіву і застигання агару чашку перевертають вверх дном, відзначають восковим олівцем номер аналізу і поміщають в термостат.
При необхідності отримання поверхневого розвитку мікрофлори певна кількість досліджуваного продукту вноситься до центру чашки Петрі із застиглим поживним середовищем і розподіляється по її поверхні шпателем Дригальського.
Бактерії, що знаходяться в продукті (або в його розведенні), потрапляючи на поживне середовище, починають розмножуватися і утворюють скупчення клітин (колонії). Після сорокавосьмигодинної витримки в термостаті колонії можна відзначати візуально і їх можна порахувати. По числу колоній, що виросли з узятої кількості матеріалу, судять про кількість мікроорганізмів, що містяться в ньому. При цьому приймається, що кожна колонія утворюється з однієї бактеріальної клітини. Метод дає можливість, крім кількісного обліку мікрофлори, провести її якісну характеристику за зовнішнім виглядом колоній шляхом мікроскопування клітин з окремих колоній і відсіву бактерій з окремих колоній в поживне середовище для подальшого докладнішого дослідження.
За наявності великого числа колоній для зручності підрахунку дно чашки розкреслюють на сектори і підраховують колонії в кожному секторі окремо. Результати, отримані при підрахунку окремих секторів, підсумовують. Кількість колоній, підраховану на одній чашці, помножують на розведення, що дає кількість бактерійних клітин в 1 г або 1 мл досліджуваної речовини.
Визначення титру методом граничних розведень. Визначення титру є приблизним методом обліку тієї або іншої бактеріальної групи шляхом визначення мінімальних кількостей досліджуваної речовини, в якій виявляються бактерії. Цей метод застосовується, головним чином, для таких мікроорганізмів, які знаходяться в порівняно малій кількості в порівнянні з іншою мікрофлорою і при висіві на чашки Петрі, особливо при великому розведенні, можуть бути пропущені.
При визначенні титру беруть розведення послідовно зменшуваних кількостей досліджуваного матеріалу (наприклад 1,0; 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 і 0,00001 мл) і вносять до поживного середовища, найбільш сприятливого для тих бактерій, яких потрібно ідентифікувати; при арбітражних аналізах кожне розведення вноситься не менше ніж в три паралельні пробірки. Метод титру широко застосовується для виявлення кишкових бактерій.
Ступінь забруднення продукту кишковою паличкою виражають як титр кишкової палички (бродильний титр), що означає найменшу кількість продукту в якому виявлені бактерії кишкової групи.