22.1 Загальна характеристика метаболізму азоту

Потреба в азоті є спільною особливістю біосинтетичних шляхів, що ведуть до утворення амінокислот і нуклеотидів. Оскільки розчинні, біологічно доступні азотовмісні сполуки у природному середовищі майже не зустрічаються, то більшість організмів дуже економно витрачають амоній, амінокислоти та нуклеотиди. Дійсно, як ми побачимо далі, вільні амінокислоти, пурини та піримідини, що утворюються під час метаболічних перетворень протеїнів і нуклеїнових кислот, часто запасаються і використовуються повторно. А тому спочатку ми розглянемо шляхи, через які азот із середовища потрапляє у біологічні системи.

Пул біологічно доступного азоту підтримується завдяки кругообігу азоту

Атмосферне повітря на одну п’яту складається з молекулярного азоту (N₂) і є найважливішим джерелом цього елементу. Однак лише декілька видів живих організмів здатні засвоювати атмосферний азот і перетворювати його на форми, доступні для всіх інших організмів. У біосфері метаболічні процеси, що відбуваються за участю різних видів живих організмів, функціонують взаємозалежно і спрямовані на зберігання та повторне використання біологічно доступних форм азоту; об’єднані ці процеси у великий цикл азоту (Рис. 22-1). Першим етапом циклу є фіксація (відновлення) атмосферного азоту азотфіксуючими бактеріями з утворенням амонію (NH₃ або NH₄⁺), який засвоюється більшістю живих організмів. Однак деякі грунтові бактерії здобувають енергію шляхом окиснення амонію спочатку до нітритів (NО₂^-), а далі до нітратів (NО₃^-). Оскільки ці бактерії дуже поширені у грунті і характеризуються високою активністю, то майже весь амоній, що потрапляє у ґрунт, окиснюється ними до нітратів; називають цей процес нітрифікацією. Рослини та багато бактерій поглинають і легко відновлюють нітрати та нітрити за допомогою ензимів нітрат- і нітритредуктаз. У рослинних організмах утворений у такий спосіб амоній включається до складу амінокислот. Тварини використовують рослини як джерело замінних і незамінних амінокислот для побудови своїх протеїнів. Після відмираня організмів мікроби розщеплюють їхні протеїни до амонію, який потрапляє у грунт, а нітрифікуючі бактерії грунту знову перетворюють його на нітрити та нітрати. Рівновага між фіксованою та атмосферною формами азоту підтримується іншою групою бактерій, які в анаеробних умовах відновлюють нітрати до молекулярного азоту, називається цей процес денітрифікацією (рис. 22-1). Ці ґрунтові бактерії використовують саме NO₃^-, а не О₂, як кінцевий акцептор електронів у серії реакцій, за допомогою яких (так само, як у випадку окисного фосфорилювання) створюється трансмембранний протонний градієнт, необхідний для синтезу АТР.

А тепер детальніше розглянемо перший етап циклу азоту, а саме процес його фіксації.

Фіксацію азоту здійснюють ензими нітрогеназного комплексу

Лише деякі прокаріотичні організми здатні фіксувати атмосферний азот. До них належать ціанобактерії, які живуть у ґрунті, прісних та солоних водах, інші вільноживучі ґрунтові бактерії, як, наприклад, різні види Azotobacter, а також азотфіксуючі бактерії, що живуть як симбіонти у кореневих бульбочках бобових рослин. Перший важливий продукт фіксації азоту - амоній, який може використовуватись всіма організмами або безпосередньо, або після його перетворення на інші розчинні сполуки, такі як нітрити, нітрати або амінокислоти.

Відновлення азоту до амонію є екзергонічною реакцією, що протікає згідно рівняння:

N₂ + 3H₂ → 2NH₃ ∆G^{′ 0} = - 33,5 кДж/моль

Потрійний зв’язок N≡ N дуже стійкий, значення енергії зв’язування складає 930 кДж/моль. Тому реакція фіксації азоту характеризується надзвичайно високою енергією активації, а атмосферний азот за звичайних умов хімічно інертний. У промисловому масштабі амоній добувають за допомогою методу Габера (названого на честь його винахідника Фріца Габера). Для забезпечення необхідної енергії активації реакцію відновлення азоту провадять у діапазоні температур 400-500⁰ та за високого тиску N₂ і H₂ (десятки тисяч кілопаскалей, тобто декілька сотень атмосфер). Біологічна ж фіксація азоту відбувається за фізіологічних температур та тиску азоту 0,8 атм, а високий енергетичний бар’єр долається за допомогою інших механізмів, зокрема, принаймні частково, завдяки зв’язуванню та гідролізу АТР. Сумарну реакцію цього процесу можна записати таким чином:

N₂ + 10 H⁺ + 8e^¯ + 16 ATР → 2 NH₄⁺ + 16 ADP + 16 P_i + Н₂

Біологічну фіксацію азоту здійснює високо консервативний комплекс протеїнів, який називають нітрогеназним комплексом (Рис. 22-2). Його головними компонентами є редуктаза динітрогенази та динітрогеназа ( Рис. 22-3). Ензим редуктаза динітрогенази (M_r 60 000) - це димер, що складається з двох однакових субодиниць і містить один 4Fe-4S окисно-відновний центр (див. Рис. 19-5) розташований між субодиницями і здатний окиснюватися і відновлюватися одним електроном. Він має також два центри зв’язування для ATP∕ADP (по одному центру на кожну субодиницю). Ензим динітрогеназа ( M_r 240 000) - тетрамер, який складається з двох копій двох різних субодиниць і містить як залізо, так і молібден; загалом його окисно-відновні центри містять 2 атоми Мо, 32 атоми Fe та 30 атомів S на тетрамер. Приблизно половина атомів заліза та сірки входить до складу двох зв’язаних пар 4Fe-4S-центрів, які називають Р-кластерами; інша частина атомів є складовими залізо-молібденового кофактору. Відкрито також іншу форму нітрогенази, яка замість молібдену містить ванадій, а у клітинах деяких видів бактерій синтезуються обидва типи нітрогеназних систем. За певних умов середовища ензим, що містить ванадій, може відігравати першочергову роль у фіксації азоту, однак на сьогодні він охарактеризований не настільки детально, як ензим, що містить молібден.

Фіксацію азоту здійснює повністю відновлена форма динітрогенази, задіяно у цьому процесі вісім електронів: шість електронів використовуються для відновлення N₂, а ще два – для утворення однієї молекули Н₂, що є обов’язковим компонентом реакції. Динітрогеназа відновлюється шляхом перенесення електронів від редуктази динітрогенази ( Рис. 22-2) Тетрамер динітрогенази містить два центри зв’язування редуктази. Необхідні для відновлення вісім електронів переносяться від редуктази на динітрогеназу один за одним наступним чином: молекула відновленої редуктази зв’язується з динітрогеназою і переносить один електрон, після цього окиснена редуктаза відділяється від динітрогенази і цикл повторюється. Кожен оборот циклу потребує гідролізу двох молекул ATP, який здійснює димерна редуктаза. Безпосереднім джерелом електронів, необхідних для відновлення редуктази динітрогенази, можуть бути різні сполуки, зокрема, відновлений фередоксин (стр. ...; див. також Рис. 19-5) або відновлений флаводоксин, певну роль можуть відігравати і інші джерела. Зокрема, можна навести приклад, коли основним джерелом електронів для відновлення фередоксину є піруват ( Рис. 22-2).

Звертає на себе увагу незвична роль АТР у цьому процесі. Нагадаємо, що АТР не тільки постачає хімічну енергію, яка вивільняється у реакції гідролізу одного або декількох фосфоангідридних зв’язків, але може також впливати на енергію зв’язування ензим-субстратного комплексу (стр. 196, 301), вступаючи у нековалентні взаємодії, що сприяє зниженню енергії активації. Як зв’язування, так і гідроліз АТР відіграють важливу роль у забезпеченні конформаційних змін редуктази динітрогенази, які допомагають подолати високу енергію активації реакції фіксації азоту. Внаслідок зв’язування двох молекул АТР з редуктазою величина відновлювального потенціалу (^Е’0) ензиму змінюється з -300 до -420 мВ. Таке підвищення відновлювальної здатності необхідне для перенесення електронів на динітрогеназу. Після цього, уже безпосередньо перед перенесенням одного електрону від редуктази динітрогенази на динітрогеназу, відбувається гідроліз АТР.

Ще однією характерною рисою нітрогеназного комплексу є його висока лабільність в умовах наявності кисню. Період на півжиття (чи пів-життя?) молекул редуктази на повітрі складає 30 с, динітрогенази - 10 хв. У вільноживучих бактерій, які фіксують азот, виявлено різні шляхи вирішення цієї проблеми. Деякі види існують лише в анаеробних умовах, у інших за наявності кисню гальмується синтез нітрогенази. В окремих аеробних видів, наприклад Azotobacter vinelandii, реакції транспорту електронів і синтезу АТР частково роз’єднані, внаслідок чого кисень, у разі потрапляння у клітину, швидко згоряє ( див. додаток 19-1). Цим зумовлено підвищення температури в культурах бактерій, що фіксують азот.

Симбіотичні взаємозв'язки між бобовими рослинами та азотфіксуючими бактеріями, що живуть у їхніх кореневих бульбочках (Рис. 22-4), забезпечують енергетичні потреби реакції фіксації азоту і запобігають деструктивному впливу кисню на нітрогеназний комплекс. Можливо, що саме потреба у енергетичному забезепеченні реакції фіксації азоту була тим рушійним еволюційним чинником, який зумовив виникнення асоціацій між рослинами та бактеріями. У таких асоціатах бактерії кореневих бульбочок отримують доступ до значних енергетичних запасів у вигляді вуглеводів та проміжних метаболітів циклу лимонної кислоти, які у великій кількості утворюються у рослинному організмі. Завдяки цьому кількість азоту, яку фіксують бульбочкові бактерії, у сотні разів перевищує ту кількість, яку зв’язують бактерії, що вільно живуть у ґрунті. У симбіотичних системах знаходить своє вирішення і проблема токсичної дії кисню на нітрогеназний комплекс. Клітини бактерій у кореневих бульбочках занурені у розчин гемовмісного протеїну леггемоглобіну, який здатний зв’язувати кисень і синтезується рослиною (хоча гемову частину цього протеїну можуть синтезувати і бактерії). Леггемоглобін зв’язує увесь доступний кисень, запобігаючи його впливу на процес фіксації азоту, і переносить його в електроно-транспортну систему бактеріальної клітини. Користь для рослини від симбіозу з бактеріями полягає у прямому постачанні відновленого азоту. Наочним прикладом ефективності симбіозу між рослинами і бактеріями є значне збагачення азотом ґрунту після вирощування на ньому бобових рослини. Цю особливість використовують для підвищення врожайності шляхом запровадження сівозміни - через кожні декілька років на місці, де вирощувались небобові рослини (наприклад, кукурудза), які поглинають з ґрунту фіксований азот, висівають бобові рослини - люцерну, горох або конюшину.

Процес фіксації азоту має велике практичне значення, а тому є предметом інтенсивних наукових досліджень. Оскільки промислове виробництво амонію, що використовується як добриво, потребує значних коштів і затрат енергії, то перспективним є отримання рекомбінантних або трансгенних організмів, здатних фіксувати азот. Дослідження у цьому напрямку розвиваються із використанням технології рекомбінантних ДНК (розділ 9), яка забезпечує перенесення ДНК, відповідальної за кодування ензимів фіксації азоту, у геном бактерій та рослин, не здатних його фіксувати. Успішне застосування таких методів залежить від того, чи вдасться уникнути токсичного впливу кисню на клітини, які синтезують нітрогеназу.

Амоній включається у біомолекули через синтез глутамату і глютаміну

Відновлений азот у формі NH₄⁺ включається спочатку до складу амінокислот, а потім – до складу інших азотовмісних біомолекул. Забезпечують таке включення дві амінокислоти - глутамат та глутамін. Пригадайте, що саме ці дві амінокислоти відіграють головну роль у катаболізмі амонію та аміногруп у процесі окиснення амінокислот (Розділ 18). Глутамат, який вступає у реакції трансамінування (це реакція, зворотна до наведеної на Рис. 18-4), служить джерелом аміногруп для більшості інших амінокислот. Азот амідної групи глутаміну також є джерелом аміногруп у широкому колі біосинтетичних процесів. У більшості клітин, а також у складі позаклітинної рідини у тканинах вищих тварин, одна або обидві ці амінокислоти наявні у концентраціях, які на порядок, чи навіть більше, перевищують концентрацію інших амінокислот. Наприклад, потреба клітини E. coli у глутаматі настільки велика, що її цитозоль складається переважно з розчину цієї амінокислоти. Шляхом зміни концентрації глутамату регулюється не тільки потреба клітини в азоті, але й осмотичний баланс між цитозолем та зовнішнім середовищем.

Шляхи біосинтезу глутамату та глутаміну досить прості, а тому деякі або усі етапи цих шляхів протікають у більшості організмів. Найважливіший шлях асиміляції NH₄⁺ у глютамат включає дві реакції. Першу з них – взаємодію глутамату і NH₄⁺ з утворенням глутаміну - каталізує ензим глутамінсинтетаза. Ця реакція протікає у два етапи з утворенням проміжного метаболіту - зв’язаного з ензимом γ-глутамілфосфату (див. Рис. 18-8).

1. Глутамат + ATP → γ-глутамілфосфат + ADP

2. γ-Глутамілфосфат + NH₄⁺ → глутамін + P_i + Н⁺

^{___________________________________________________________________________}

Сумарна реакція: Глутамат + NH₄⁺ + ATP → глутамін + ADP + P_i + Н⁺ (22 –1)

Глутамінсинтетаза виявлена в усіх організмах. Окрім участі у включенні NH₄⁺ у біомолекули у бактеріальних клітинах, ензим відіграє центральну роль у метаболізмі амінокислот у ссавців, перетворюючи токсичний вільний NH₄⁺ у глутамін, який переноситься з кров’ю (Розділ 18).

У бактеріальних і рослинних клітинах глутамат утворюється з глутаміну внаслідок реакції, яку каталізує ензим глутаматсинтаза. α-Кетоглутарат, проміжний продукт циклу лимонної кислоти, зазнає віновлювального амінування, реагуючи з глутаміном як донором азоту:

α-Кетоглутарат + глутамін + NADPH + H⁺ → 2 глутамат + NADP⁺ ( 22-2)

Сумарна реакція, яку каталізують глутамінсинтетаза та глутаматсинтаза (Рівн. 22-1 та 22-2), має вигляд:

α-Кетоглутарат + NH₄⁺ + NADPH + ATP → L-глутамат + NADP⁺ + ADP + P_i

У тваринних клітинах глутаматсинтаза відсутня, а високий рівень глутамату підтримується завдяки трансамінуванню α-кетоглутарату в ході катаболізму амінокислот.

Глутамат може також утворюватись іншим, менш поширеним шляхом внаслідок реакції між α-кетоглутаратом та NH₄⁺, що протікає в один етап. Каталізує цю реакцію L-глутаматдегідрогеназа – ензим, наявний у всіх організмах, у якості відновлювального еквіваленту у реакції використовується NADPH:

α-Кетоглутарат + NH₄⁺ + NADPH → L-глутамат + NADP⁺ + Н₂О

Ми розглядали цю реакцію в розділі, присвяченому катаболізму амінокислот (див. Рис. 18-7). У еукаріотичних клітинах L-глутаматдегідрогеназа локалізована у мітохондріальному матриксі. Рівновага реакції зміщена у бік вихідних реагентів, значення K_m для NH₄⁺ (~1 мМ) є таким високим, що ця реакція не може мати суттєвого значення для включення NH₄⁺ у амінокислоти та інші метаболіти. (Пригадайте, що саме зворотна глутаматдегідрогеназна реакція (Рис. 18-10) є одним із джерел надходження NH₄⁺ у цикл сечовини). Глутаматдегідрогеназна реакція, що потребує високої концентрації NH₄ , може відігравати суттєву роль у підриманні рівня глутамату лише за умов внесення NH₃ у грунт або вирощування організмів у лабораторії на високих концентраціях NH₃. У клітинах грунтових бактерій та рослин переважно функціонує описаний вище двохетапний шлях включення NH₄⁺ у амінокислоти за участю двох ензимів (Рівняння 22-1, 22-2).

Глутамінсинтетаза - основний регуляторний ензим метаболізму азоту

Активність глутамінсинтетази регулюється в усіх організмах, що не є дивним, враховуючи центральну метаболічну роль цього ензиму в надходженні відновленого азоту. У клітинах кишкових бактерій, наприклад E. coli, регуляція активності цього ензиму відбувається за досить складним механізмом. Молекула ензиму складається з 12 ідентичних субодиниць з Мr 50000 ( Рис. 22-5), його активність регулюється як алостерично, так і шляхом ковалентної модифікації. Роль алостеричних інгібіторів виконують аланін, гліцин та ще принаймні шість кінцевих продуктів метаболізму глутаміну (Рис. 22-6). Кожен з інгібіторів сам по собі пригнічує активність ензиму лише частково, однак усі разом вони проявляють не просто сумарний, а значно більший ефект, і практично повністю „виключають” ензим. Такий механізм регуляції забезпечує постійне підтримання глутамату на рівні, необхідному для негайного задоволення метаболічних потреб клітини.

На ефективність алостеричної регуляції значно впливає пригнічення ензиматичної активності шляхом аденілілування (приєднання AMP) залишка Tyr³⁹⁷, розміщеного поблизу активного центру ензиму (Рис. 22-7). Внаслідок такої ковалентної модифікації підвищується чутливість ензиму до алостеричних інгібіторів, і по мірі того, як все більша кількість субодиниць зазнає аденілілування, активність його знижується. Реакції аденілілування і деаденілілування каталізує ензим аденілілтрансфераза (АТ на Рис. 22-7), що є частиною складного ензиматичного каскаду, який реагує на рівень глутаміну, α-кетоглутарату, ATP та P_i. Активність аденілілтрансферази залежить від зв’язування з регуляторним протеїном Р_ІІ, активність якого регулюється шляхом ковалентної модифікації (уридилілування) його молекули також за залишком Tyr. Аденілілтрансферазний комплекс, що містить уридилілований Р_ІІ (Р_ІІ-UMP), прискорює деаденілілування глутамінсинтетази, тоді як той самий комплекс, але з деуридилілованим Р_ІІ, прискорює її аденілілування. Уридилілування і деуридилілування Р_ІІ каталізує один і той же ензим – уридилілтрансфераза. Уридилілування пригнічується, якщо з уридилілтрансферазою зв’язується глутамін і P_i, або, навпаки, зростає, якщо з протеїном Р_ІІ зв’язується α-кетоглутарат і АТP.

Наведеними прикладами механізми регуляції глутамінсинтетази не вичерпуються. Уридилілований Р_ІІ також опосередковує активацію транскрипції генів, що кодують глутамінсинтетазу, підвищуючи таким чином концентрацію ензиму в клітині, тоді як деуридилілований Р_ІІ знижує транскрипцію вказаних генів. Цей механізм включає взаємодію Р_ІІ з додатковими протеїнами, задіяними у регуляції генів, типу описаних у розділі 28. Результатом функціонування цієї складної системи контролю є зниження активності глутамінсинтетази за умови високого рівня глутаміну і, навпаки, підвищення активності ензиму у разі низького рівня глутаміну та наявності α-кетоглутарату і АТР (субстратів синтетазної реакції). Множинність рівнів регуляції забезпечує високу чутливість реакції синтезу глутаміну до потреб клітини, що постійно змінюються.

Деякі типи реакцій відіграють особливу роль у біосинтезі амінокислот та нуклеотидів

Описані у цьому розділі метаболічні шляхи включають різноманітні і цікаві з хімічної точки зору перетворення. Перед тим, як перейти до характеристики самих шляхів, варто зупинитись на деяких вже знайомих нам перетвореннях, що заслуговують особливої уваги, а саме: (1) реакціях трансамінування та інших структурних перегрупуваннях, які протікають за участю ензимів, що містять піридоксальфосфат; (2) перенесенні одновуглецевих груп за допомогою кофакторів тетрагідрофолату (зазвичай це ступінь окиснення ─СНО та ─СН₂ОН) або S-аденозилметіоніну (ступінь окиснення ─СН₃ ); (3) перенесенні аміногруп, що походять з амідного азоту глутаміну. Піридоксальфосфат (ПФ), тетрагідрофолат (Н₄-фолат) та S- аденозилметіонін (adoMet) детально описані у розділі 18 (див. Рис. 18-6, 18-17, 18-18). Тут ми зосередимось на перенесенні аміногруп, що містять амідний азот глутаміну.

Відомо понад десяток біосинтетичних реакцій, у яких основним фізіологічним джерелом аміногруп виступає глутамін, більшість із них входять до метаболічних шляхів, описаних у цьому розділі. Ензими, які каталізують ці реакції, відносять до класу глутамінамідотрансфераз. Вони містять два структурних домени: один для зв’язування глутаміну, інший для зв’язування другого субстрату - акцептора аміногрупи (Рис. 22-8). Вважають, що консервативний залишок Cys у складі домену, який зв’язує глутамін, діє як нуклеофіл, забезпечуючи розщеплення амідного зв’язку глутаміну та формування ковалентно зв’язаного глутаміл-ензимного проміжного продукту. Утворений у цій реакції NH₃ не вивільняється, а переноситься по так званому „амонійному каналу” до іншого активного центру, де взаємодіє з другим субстратом з утворенням амінованого продукту. Ковалентно зв’язаний проміжний продукт реакції гідролітично розщеплюється на ензим та глутамат. Якщо виникає потреба в активації другого субстрату, тоді за участю АТФ утворюється ацил-фосфатний проміжний продукт (R-ОХ на рис. 22-8, де Х позначає фосфорильну групу). Таким же способом діє ензим глутаміназа, з тією різницею, що в якості другого субстрату використовується Н₂О, а продуктами реакції є NH₄⁺ та глутамат (Рис.18-8).

Підсумок 22.1 Загальна характеристика метаболізму азоту

• Більшість живих організмів не здатна використовувати молекулярний азот (вміст якого у атмосфері Землі становить 80%), доки він не буде відновлений. Фіксують атмосферний азот деякі вільноживучі ґрунтові бактерії та бактерії-симбіонти кореневих бульбочках бобових рослин.

• Цикл азоту у біосфері складається із таких етапів: утворення амонію шляхом фіксації N₂ у клітинах бактерій; нітрифікація амонію ґрунтовими мікроорганізмами з утворенням нітратів; перетворення нітратів на амоній у клітинах вищих рослин; синтез амінокислот з амонію в клітинах усіх організмів; перетворення нітратів в N₂ денітрифікуючими ґрунтовими бактеріями.

• Фіксація N₂ у вигляді NH₃ здійснюється нітрогеназним комплексом впродовж реакції, що потребує АТР. За наявності О₂ нітрогеназний комплекс дуже нестійкий.

• У живих системах відновлений азот включається спочатку до складу амінокислот, а потім до складу інших біомолекул, у тому числі нуклеотидів. Попередником багатьох біомолекул є амінокислота глутамат. Амінокислоти глутамат та глутамін функціонують у якості донорів азоту у широкому спектрі біосинтетичних реакцій. Глутамінсинтетаза, яка каталізує реакцію утворення глутаміну з глутамату, є основним регуляторним ензимом у процесі метаболізму азоту.

• На шляхах біосинтезу амінокислот та нуклеотидів багаторазово використовуються такі біологічні кофактори, як піридоксальфосфат, тетрагідрофолат та S-аденозилметіонін. Піридоксальфосфат необхідний для протікання реакцій трансамінування за участю глутамату та для перетворень інших амінокислот. S-аденозилметіонін та тетрагідрофолат задіяні у перенесенні одновуглецевих груп. Глутамінамідотрансферази каталізують реакції включення азоту, який походить з глутаміну.