37. Принципи методу іфа

Імуноферментний аналіз (ІФА) або, точніше, ферментний імуносорбентний аналіз (англ. enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA) — імунологічний метод для визначення наявності певних антигенів, що заснований на ідентифікації комплексів антиген-антитіло. Широко використовується в лабораторній діагностиці.

Існує цілий ряд підходів, що дозволяють визначити, чи відбулося зв’язування антитіла з антигеном-мішенню. Один з них — це ферментний іммуносорбентний аналіз (ELISA), що часто використовується для діагностики різноманітних антигенів. Процедура аналізу включає такі етапи:

Схема проведення аналізу

Підготовка підкладки для фіксації досліджуваного зразка;

Зразок, у якому хочуть виявити специфічну молекулу або мікроорганізм, фіксують на твердій підкладці, наприклад на пластиковій мікротитрувальній плашці, що зазвичай має 96 лунок;

До фіксованого зразка додають антитіло, специфічне до маркерної молекули (перше антитіло), потім промивають лунку, щоб видалити молекули першого антитіла, які не зв'язалися;

Додають друге антитіло, що специфічно зв'язується з першим антитілом і не взаємодіє з маркерною молекулою. До цього антитіла приєднаний фермент (наприклад, лужна фосфатаза, пероксидаза або уреаза), що може каталізувати перетворення незабарвленого субстрату в забарвлений продукт. Промивають лунку, щоб видалити молекули, які не зв'язалися;

Додають незабарвлений субстрат, що впізнається та утилізується ферментом;

Проводять якісне або кількісне визначення пофарбованого продукту.

Принципи ІФАналізу

Компоненти ІФА

На початку 1970-х років був запропонований метод, який поєднує ферментативний та імунохімічний підходи, що призвело до створення імуноферментного аналізу (ІФА), в якому антитіло виступає як специфічний детектор речовини, що визначається, а фермент – як маркер імунохімічної реакції, з допомогою якого візуалізується утворення комплексів.

Компоненти ІФА

 Антиген

 Специфічні антитіла

 Антитіла специфічні мічені ферментом або антивидові антитіла, мічені ферментом

 Субстрат

ІФА проводиться в 6 основних етапів

1) фізична сорбція антитіл (або антигену) на твердофазний носій;

2) імунологічна реакція: внесення антигену (або антитіл) в ті ж лунки;

3) імунологічна реакція (друге специфічне зв’язування): внесення комплексу кон’югат-фермент, хімічним шляхом зв’язаного з антитілами;

4) ензиматична реакція, коли фермент, діючи на субстрат, сприяє появі забарвленого комплексу; інтенсивність забарвлення пропорційна кількості антигену (або антитіла) в лунках;

5) стоп-реакція (фіксація забарвлення в лунці)

6) врахування результатів з допомогою приладів – спектрофотометрів, які дозволяють вимірювати оптичну густину продукту ферментативної реакції безпосередньо в лунках імунологічного планшету

NB!!! – між пунктами 1-4 обов’язковий етап відмивки

Можна виділити три основні стадії:

- формування специфічного комплексу АГ-АТ.

- введення в нього мітки (імунохімічний процес).

- візуалізація мітки.

Перед постановкою ІФА проводиться робота, яка включає такі етапи:

- вирощування біологічно чистого матеріалу з моно інфекцією.

- отримання очищених вірусних препаратів.

- приготування анти сироваток з високим титром специфічних антитіл.

- виділення IgG.

- кон’югування з ферментами.

Після з’єднання АГ або АТ з твердим носієм можна проводити реакцію прямого, непрямого, конкурентного і сандвіч-типу.

Прямий імуноферментний аналіз:лунки мікроплат покривають тестуючим антигеном, інкубують, потім надлишок антигену видаляють і додають вірусоспецифічне антитіло, кон’юговане з ферментом. Після інкубації надлишок кон’югату видаляють і додають субстрат (хромоген). Інтенсивність забарвлення пропорційна кількості антигену. Метод потребує мінімальної кількості операцій, незначної витрати реагентів і легко може бути автоматизований.

Непрямий ІФА: після з’єднання АГ-АТ, до комплексу на твердому носії додають антивидові антитіла, що мають мітку АТ2-Ф (у прямому, ферментну мітку додають не у антивірусні імуноглобуліни, а у антитіла до них).

Сендвіч – ІФА: при простому варіанті ферментна мітка вводиться до складу вторинних антитіл, а при модифікованому – вторинні антитіла проявляються комплементарними до них анти видовими ензим-міченими імуноглобулінами.