Організація геному втм
Показані позиції 4х генів:
А, В – кодують білки РзРп (РНК-залежної РНК-полімерази);
С – кодує білок руху;
D- кодує структурний білок
Геном вірусу грипу
1. 2341 bp Компонент РНК-транскриптази; зв’язування мРНК господаря
(30-60 копій на віріон)
2. 2341 bp Компонент РНК-транскриптази; ініціація транскрипції(30-60 копій на віріон)
3. 2233 bp Компонент РНК-транскриптази; елонгація транскрипції(30-60 копій на віріон)
4. 1778 bp Гемаглютинін; головна антигенна детермінанта; рецептор(500 копій на віріон)
5. 1565 bp Компонент РНК-транскриптази; рибонуклеопротеїд(1000 копій на віріон)
6. 1413 bp Нейрамінідаза; поверхневий глікопротеїд(100 копій на віріон)
7. 1027 bp Матриксний білок; (3000 копій на віріон)Неструктурний білок; функція невідома
8. 890 bp Неструктурний білок; функція невідома Неструктурний білок; функція невідома
Реасортація геномів вірусу грипу
Реассортация между вирусом гриппа птиц H5N1 и вирусом
гриппа человека H3N2 приводит к образованию гибридных
вирусов с высоким уровнем вирулентности
Генетична карта віл
Принципи методу плр
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – експериментальний метод молекулярної біології, що дозволяє досягти значного збільшення невеликих концентрацій певних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) в біологічному матеріалі (пробі).
Метод ПЛР заснований на багатократному вибірковому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів у штучних умовах (in vitro). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє задані умови, і тільки в тому випадку, якщо вона присутня у дослідному зразку. На відміну від реплікації, за допомогою ПЛР ампліфікуються відносно короткі ділянки ДНК. За допомогою суміші різних полімераз, з використанням добавок і при певних умовах довжина ПЛР – фрагменту може досягати 20 – 40 тисяч пар нуклеотидів.
Компоненти реакції:
ДНК-матриця, що містить ту ділянку ДНК, яку треба ампліфікувати.
Два праймери, комплементарні протилежним кінцям різних ланцюгів потрібного фрагменту ДНК.
Термостабільна ДНК-полімераза — фермент, який каталізує реакцію полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі довгий час, тому використовують ферменти, що були виділені з термофілів - Thermus aquaticus (Taq-полімераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полімераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полімераза) та інші.
Дезоксинуклеозидтрифосфати (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Іони Mg2+, необхідні для роботи полімерази.
Буферний розчин, що забезпечує необхідні умови реакції — рН, іонну силу розчину.
Специфічність ПЛР заснована на утворенні комплементарних комплексів між матрицею та праймерами. Кожен з праймерів комплементарний одній з ланцюгів дволанцюгової матриці і обмежує початок та кінець ділянки, що ампліфікується. ПЛР проводять в ампліфікаторі - приладі, що забезпечує періодичне охолоджування і нагрівання пробірок, зазвичай з точністю не менше 0,1 ° C. Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20 – 35 циклів, кожний з яких складається з трьох стадій:
Денатурація. Дволанцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 94-96 ° C на 0,5-2 хв., щоб ланцюги ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією, так як руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами ДНК.
Відпал. Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли зв'язатися з одноланцюжковою матрицею. Температура відпалу залежить від складу праймерів і зазвичай вибирається на 4-5 ° С нижче їх температури плавлення. Час стадії - 0,5-2 хв.
Елонгація. На цій стадії ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюг, використовуючи праймер в якості затравки. Полімераза починає синтез другого ланцюга від 3'-кінця праймера, який зв'язався з матрицею, і рухається уздовж матриці в напрямку від 3 'до 5'. Температура елонгації залежить від полімерази. Часто використовувані полімерази Taq і Pfu найбільш активні при 72 °C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини фрагменту, що ампліфікується. Звичайний час елонгації приймають рівним одній хвилині на кожну тисячу пар основ. Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюгові фрагменти. Ця стадія триває 7-10 хв.