Розділ 2. Методи одержання та промислові способи виробництва ергостерину

1. Джерела одержання ергостерину

У природі джерелом вітамінів є головним чином рослини та мікроорганізми. Менахінони та кобаломіни синтезуються виключно мікроорганізмами. Мікробіологічним шляхом одержують ергостерин, вітамін В₁₂, вітамін В₂, а також β-каротин – попередник вітаміну А. Крім того, мікроорганізми використовуються для виробництва каротиноїдів, а також як селективні окисники сорбіту в сорбозу у процесі виробництва вітаміну С [20].

Вітамін D - це група споріднених сполук, в основі яких знаходиться ергостерин, який виявлений в клітинних мембранах еукаріот. Джерелом ергостерину є фітопланктон, бурі і зелені водорості, але особливо багаті на ергостерин дріжджі та плісняві гриби, які слугують сировиною для його промислового виробництва. Ергостерин – основний стерин дріжджів, на який припадає 60–90 % від інших стеринів [21]. Вміст ергостерину в дріжджових клітинах коливається в межах 0,2 – 11% від сухої біомаси. Дріжджі Saccharomyces cerevisiae застосовують для отримання ергостерину, як провітаміну, що володіє антирахітичною дією. Міцеліальні гриби – аспергіли і пеніціли містять 1,2 – 2,2% ергостерину [22].

2. Вплив основних факторів і параметрів на процес біосинтезу ергостерину

Одержання ергостерину у промислових умовах можна розподілити на наступні етапи: підготовка посівного матеріалу, розмноження початкової культури і накопичення інокуляту, ферментація, сепарування клітин, опромінення клітин ультрафіолетовими променями, висушування та упаковка цільового продукту.

Так, стосовно дріжджів Saccharomyces cerevisiae, інокулят отримують на середовищах, що забезпечують повноцінний розвиток клітин, після чого основне середовище з ацетатом, збагачене джерелом вуглецю і зниженою кількістю азоту, засівають порівняно великим обємом інокуляту. Адже для біосинтезу стеринів важливо, щоб середовище містило великий надлишок вуглецю за ліміту азоту, тобто високе співвідношення C/N [20, 22].

Культивування дріжджів (ферментацію) проводять при температурі, близькій до оптимальної для дріжджів Saccharomyces cerevisiae, і вираженій аерації (2 % О₂ в газовій фазі). Адже важливою умовою синтезу ергостерину дріжджами є інренсивна аерація. В анаеробних умовах в клітинах накопичується попередник ергостерину – сквален. Індукція синтезу ергостерину починається за 0,03 % - го вмісту кисню в газовій фазі і досягає максимуму за 2 % - ї концентрації.

Стимуляторами синтезу є також вітаміни і насамперед пантотенова кислота, яка у складі KоA бере участь у побудові молекули ергостерину. Синтез стеринів не пов’язаний із ростом дріжджів. Вміст стеринів підвищується по мірі старіння культури і стериноутворення продовжується після зупинки росту дріжджів [20, 22].

н – алкани та ацетат (активатор біосинтезу стеринів), якщо вони можуть споживатись дріжджами, являються кращим джерелом вуглецю для синтезу ергостерину, ніж вуглеводи. Можливо, це пов’язано з утворенням із алканів ацетату (попередника ергостерину) в результаті окиснення алканів.

Полієнові антибіотики (напр. ністатин), взаємодіючи з мембраною дріжджів, підвищують рівень стеринів на 50 – 60 % по відношенню до контролю [20, 22].

Через 3 - 4 доби, залежно від ростових характеристик і біосинтетичної активності культури, клітини сепарують і піддають вакуум-висушуванню. Потім сухі дріжджі опромінюють ультрафіолетовими променями - УФ (довжина хвилі 280-300 нм) протягом оптимального за тривалістю часу, при необхідній температурі і з урахуванням домішкових речовин. Ці контрольовані показники, встановлені дослідним шляхом, вказуються в регламентній документації. Опромінення дріжджів можна проводити до сепарування клітин в тонкому шарі 5 % суспензії, з огляду на малу проникаючу здатність УФ [22].

Опромінені сухі дріжджі застосовують у тваринництві. В промисловості їх випускають під назвою "Кормові гідролізні дріжджі, збагачені вітаміном D₂". У такому препараті міститься не менше 46% сирого білка, незамінні амінокислоти (лізин, метіонін, триптофан) і 5000 MО вітаміну D₂.

У разі отримання кристалічного вітаміну D₂ клітини продуцента гідролізують соляною кислотою при 110 °С, потім температуру знижують до 75-78 °С і додають етанол. Суміш фільтрують при 10-15 °С, що залишилася після фільтрації, масу промивають водою, висушують, подрібнюють, нагрівають до 78 °С та двічі обробляють потрійним об'ємом етанолу. Спиртові екстракти об'єднують і упарюють до 70 %-го вмісту сухих речовин. Отриманий "ліпідний концентрат" обробляють розчином їдкого натру. Ергостерин кристалізується з неомиленої фракції концентрату при 0 °С. Його очищають повторною перекристалізацією. Кристали висушують, розчиняють в сірчаному ефірі, опромінюють УФ, ефір відганяють, розчин вітаміну D₂ концентрують і кристалізують. "Кислотний фільтрат" зазвичай упарюють до 50 %-го змісту сухих речовин і використовують як концентрат вітамінів. Виготовляють також масляний концентрат вітаміну D₂ [20].