Методики визначення

Визначення концентрації біомаси [37]

Концентрацію біомаси визначаємо за оптичною густиною клітинної суспензії із наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу у відповідності з калібрувальним графіком.

У пробірки із 9 мл дистильованої води вносимо по 1 мл культуральної рідини. Суміш збовтується, потім вимірюється оптична густина (при 540 нм). Кількість абсолютно сухої біомаси (г/л) визначають за допомогою калібрувального графіка.

Визначення концентрації цільового продукту [30]

Екстракція ергостерину: П’ять мілілітрів культуральної рідини (розведена в 50 разів) центрифугують (4000 оборотів в хвилину, 10 хвилин), щоб відокремити клітини дріжджів від культуральної рідини. Потім клітини переносять в колбу на 100 мл та додають 8 г KOH і 32 мл 60% розчину етанолу. Для омилення суміш витримують на водяній бані при температурі 80 ± 2 °С протягом 2 годин. Для вилучення ергостерину додають 25 мл петролейного ефіру.

Аналітичний метод: концентрацію цільового продукту визначають методом високоефективної рідинної хроматографії (LC-10Atvp, SHIMADZU; в колонці заповненій силікагелем, 4мм х 250 мм; рухома фаза: суміш н-гексану і тетрагідрофуран (85:15), швидкість потоку 1,0 мл/хв., ергостерин виявляють ультрафіолетовим фотометричним детектором при довжині хвилі 280 нм). Для простоти, ергостерин визначають також кількісно за допомогою спектрофотометра при довжині хвилі 280 нм.

Суть методу полягає в розділенні складних сумішей, яке відбувається через відмінності в рівноважному розподілі їх між двома фазами, що не змішуються, одна з яких нерухома, а інша рухома. Суміші нерівно розподіляються між двома фазами завдяки своїх полярності, розміру або іншим властивостям. Процес аналізу проби відбувається у два етапи – розділення проби на складові компоненти та детекція і вимірювання кожного компоненту.

Розділення відбувається за рахунок спеціальної хроматографічної колонки, яка являє собою трубку, заповнену сорбентом, через яку подають рідину (елюент) певного складу з постійною швидкістю. В цей потік додається точно виміряна доза проби суміші. Компоненти проби, завдяки різній спорідненості до сорбенту колонки, рухаються по ній з різною швидкістю і досягають детектору в різні проміжки часу.

Ідентифікація сполук здійснюється по часу їх утримання. Кількісне визначення кожного з компонентів розраховують, виходячи з величини аналітичного сигналу, виміряного за допомогою детектора, який під’єднується до виходу хроматографічної колонки.

Кількість ергостерину визначається спектрофотометричним методом при довжині хвилі 280 нм та методом високоефективної рідинної хроматографії. При культивуванні штаму S. cerevisiae Y-E-1 концентрація ергостерину в культуральній рідині повинна бути 2 г/л [30].

Визначення концентрації джерела вуглецю [38]

Для визначення концентрації глюкози в культуральній рідині використовують реакції Фелінга. Суть методу полягає в тому: в результаті змішування робочих розчинів Фелінг І та Фелінг ІІ утворюється гідроксид міді, який легко відновлюється до вільної міді альдегідної групи глюкози. Мідь, що виділилась, відновлює йодистий калій до вільного йоду, який далі відтитровують розчином тіосульфату, використовуючи як індикатор крохмаль.

В колбу піпеткою вносять 5–9 мл проби, що досліджується і доводять дистильованою водою до загального об’єму 10 мл.

Із бюретки додають по 10 мл розчину Фелінга І і Фелінга ІІ. Колбу ставлять на плитку і кип’ятять протягом 2 хвилин. Після охолодження додають 15 – 20 мл 20 % сірчаної кислоти і 3 г йодистого калію. Йод, що виділився, титрують 0,1 н розчином тіосульфату. Коли розчин йоду починає світлішати, додають 2 – 3 краплини крохмалю і продовжують титрувати до зникнення синього забарвлення і виділення синього осаду. Кількість міді, яка пішла на реакцію з глюкозою, визначають за формулою:

Сu = ((a - b) · k · 6,36) / C,

де а – кількість 0,1 н розчину тіосульфату, яка пішла на титрування досліджуваного розчину, мл; b – кількість 0,1 н розчину тіосульфату, яка пішла на титрування контрольного розчину, мл; k – поправочний коефіцієнт, k = 1; 6,36 – кількість мл Cu, яка відповідає 1 мл 0,1 н тіосульфату; С – кількість досліджуваного розчину, яка пішла на титр, мл.

Визначення концентрації джерела азоту [39]

Метод Несслера – найбільш загальноприйнятий і поширений для визначення вмісту аміаку і амонійних солей. Він заснований на утворенні колоїду, пофарбованого в червоно-бурий колір, при взаємодії аміаку і амонійних солей з реактивом Несслера – лужним розчином мер-курііодіда калію (KIHgII).

Забарвлення, що з’являється, поглинає випромінювання в широкому діапазоні довжин хвиль і в певних умовах інтенсивність пропорційна кількості амонію. Дослід проводять при λ = 400 – 425 нм (для кількостей < 0,2 мг NH₃) і при λ = 550 – 580 нм (для ≈ 1 мг). При вимірюванні на спектрофотометрі межа концентрацій може бути розширена до 1,25 мг (при λ = 580 нм). При визначенні мікрограмових кількостей азоту оптична щільність розчинів зберігається постійною протягом 6 годин після додавання реагентів. Коливання температури в межах 20 – 40 ⁰С не впливають на результати визначення. Якщо реакція протікає довше 15 – 20 хв., То при вмісті азоту > 1 мг може спостерігатися опалесценція або помутніння розчину (свідчить про неточність результатів). Однією з причин, що викликають ці негативні реакції, є пари органічних розчинників (особливо кетонів, спиртів, хлороформу), тому рекомендується визначати азот за методом Несслера в приміщеннях, що не містять органічних розчинників. Для отримання точних результатів необхідно строго дотримуватися умов проведення реакції та приготування реактиву Несслера. Концентрація аналізованого розчину повинна бути в межах 0,5 – 0,6 н.

Мікробіологічний контроль [20]

Першим етапом мікробіологічного контролю є перевірка культуральної рідини на чистоту за допомогою мікроскопіювання (у пробах повинні бути тільки колонії біологічного агента – S. cerevisiae Y-E-1), але деякі мікроорганізми мають надзвичайно малі розміри, їх буде не видно у мікроскопі, тому необхідно зробити висів до ізольованих колоній на м'ясо-пептонний агар (МПА) (для бактерій) та глюкозо-картопляний агар (ГКА) (для грибів і дріжджів). Посів проводять за всіма правилами асептики. Посівний матеріал розподіляють по всій поверхні поживного середовища. Посіви на ГКА інкубують при 30 °С, результати посівів рахувати через 2 – 4 діб інкубування (48, 72 та 96 годин)

Після інкубації посівів на середовищах МПА не повиненно бути виявлено ріст сторонньої мікрофлори, на середовищі ГКА – грибів і дріжджів. Мікробіологічний контроль здійснюють кожні 4 години.