2. Результаты эксперимента и обсуждение

Цель настоящего исследования — изучение воздействия криотерапии на вязко-эластические свойства цитоплазматической мембраны лимфоцитов спортсменов in vivo методом атомно-силовой микроскопии.

Проведено исследование влияния общего газового холодового воздействия на иммунокомпетентные клетки — лимфоциты при температуре минус 110°С. Задачей которого было выявить упругие характеристики и силы поверхностной адгезии лимфоцитов. А также оценить влияние температуры на состояние клеток и рассчитать модуль упругости.

Модуль Юнга (модуль упругости) — физическая величина, характеризующая свойства материала сопротивляться растяжению/сжатию при упругой деформации. Назван в честь английского физика XIX века Томаса Юнга. В динамических задачах механики модуль Юнга рассматривается в более общем смысле — как функционал среды и процесса [58].

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) как один из современных методов клеточной биологии дает возможность при высоком разрешении молекулярной визуализации клеточных мембран изучить механические свойства мембран, определяющие течение физиологических и патологических процессов в клетке.

Исследование проводилось на атомно-силовом микроскопе, с помощью которого можно было визуализировать поверхность клетки в формате 3D. Этот метод позволяет хорошо рассмотреть поверхность лимфоцитов, его шероховатость, выпячивания псевдоподий. АСМ позволяет определить модуль упругости на разных участках клетки. Забор крови у пациентов производился 3 раза: до посещения криокамеры, после и через 2 недели.

Анализ результатов атомно-силовой спектроскопии упругих деформаций лимфоцитов периферической крови позволил выявить, что клеточная мембрана лимфоцитов пациентов прошедших курс криотерапии по сравнению с пациентами не подвергавшихся воздействию холода характеризуется более низкими значениями модуля Юнга.

На каждом препарате лимфоцитов было проведено 9 измерений модуля упругости, все полученные данные обрабатывались с помощью трёх программ: NanoFiz 1.0-оптимизированная программа для расчёта модуля Юнга, дает возможность построения графиков зависимости глубины внедрения зонда в образец; SurfaceExplorer- эта программа дает возможность сканирования изображения, просмотр получившейся картинки в нескольких проекциях, получение 3D изображения, позволяет рассмотреть структурные изменения в мембране клеток; Origin 60 - программа, предоставляющая исключительные возможности по анализу научных данных и построению графиков, обладает широкими возможностями: импорт данных из текстовых и бинарных файлов при помощи Import Wizard, более 60-ти основных типов графиков, 2D и 3D графики, вставка рисунков на график, практически безграничные возможности изменения внешнего вида графиков, инструменты для фитирования данных, статистической обработки. Полученные данные отображены на рисунке 3.2.

Рисунок 3.2 — Модули упругости до, после и через 3 недели прохождения курса криотерапии

До прохождения курса общего холодового воздействия модуль Юнга составлял (197,89±23,49) кПа.

После прохождения криотерапии модуль Юнга у пациентов снизился до (98,59±16,25) кПа. Такие показатели говорят о том, что в организме нет воспалительных процессов, криотерапия сдерживает неблагоприятные факторы действия на организм.

Через 3 недели после курса ОГКТ модуль упругости составлял (150,37±20,73) кПа.

Модуль Юнга характеризует способность поверхности сопротивляться упругим деформациям, возникающим при заданной величине напряжений, следовательно, чем больше его значения, тем меньше упругие деформации и выше жёсткость клетки. Так же при помощи АСМ мы смогли определить параметр шероховатости мембраны лимфоцитов R_a.

Шероховатость поверхности — совокупность неровностей поверхности с относительно малыми шагами на базовой длине. Измеряется в микрометрах (мкм).

Рассматривая полученные 3D изображения лимфоцитов до прохождения криотерапии, четко видно, что мембраны клетки имеют шероховатую поверхность и впадины в виде кластеров, на которой расположены псевдоподии, они служат для передвижения. Этот факт свидетельствует о напряженном состоянии иммунной системы. При этом мембраны лимфоцитов были без глобулярных выступов. R_a=172,8 nm на участке 1,6х1,6 мкм.

а)	б)
Рисунок 3.3 — АСМ-изображения лимфоцитов до криотерапии; а – топография поверхности – область сканирования 6,8х6,8 мкм; б – изображение в режиме латеральных сил – область сканирования 1,6х1,6 мкм

После прохождения курса общего газового холодового воздействия лимфоциты визуализировались без образования псевдоподий, что свидетельствует об отсутствии напряжения иммунной системы. Псевдоподии не выпячиваются на поверхности лимфоцитов, это говорит о том, что в организме нет воспалительного процесса. Клетки под микроскопом выглядят ровными, с гладкой поверхностью мембраны и можно рассмотреть глобулярные выступы. Ниже приведены рисунки для сравнения цитоплазматической мембраны лимфоцитов. R_a=84,0 nm на участке 1,6х1,6 мкм.

а)		б)
Рисунок 3.4 — АСМ-изображения лимфоцитов после криотерапии; а — топография поверхности – область сканирования 5,9х5,9 мкм; б — изображение в режиме латеральных сил – область сканирования 1,6х1,6 мкм
а)	б)
Рисунок 3.5 — АСМ-изображения лимфоцитов через 3 недели после криотерапии; а — топография поверхности – область сканирования 8,7х8,7 мкм; б — изображение в режиме латеральных сил – область сканирования 1,6х1,6 мкм

Через 3 недели после криотерапии были сделаны снимки лимфоцитов и выявлено, что снова начинают выпячиваться псевдоподии, поверхность мембраны становиться неровной, шероховатой. Этот факт объясняется тем, что иммунная система организма человека под действием неблагоприятных факторов окружающей среды проходит процесс релаксации по направлению к исходному состоянию, эффект после криотерапии начинает снижаться. А наличие псевдоподий свидетельствует о возврате напряженного состояния иммунной системы. Ra=133,2 nm на участке 1,6х1,6 мкм.

Таблица 3.1 — Параметр шероховатости лимфоцитов на участке 1,6х1,6 мкм

Время	Параметр шероховатости	Топография поверхности
До ОГКТ	Ra=172,8 nm на участке 1,6х1,6 мкм
После ОГКТ	Ra=84,0 nm на участке 1,6х1,6 мкм
Через 3 недели	Ra=133,2 nm на участке 1,6х1,6 мкм

Из выше приведённых данных можно сделать следующие выводы:

1. Результаты исследований показали, что АСМ дает возможность оценить влияние общего газового холодового воздействия на молекулярную структуру цитоплазматической мембраны лимфоцитов крови.

2. Более низкие значения модуля упругости позволяют предположить, что происходит изменение механических свойств мембраны:

— повышение вязко-эластических свойств, понижение жесткости, которое сопровождается повышением устойчивости к гидродинамическому смыву;

— с повышением эластичности снижение адгезивности мембраны лимфоцитов;

— изменение функциональной активности [59].

3. Различия в показателях модуля Юнга цитоплазматической мембраны лимфоцитов отражают изменения пространственной организации молекулярной структуры цитоплазматической мембраны, происходящие под влиянием общего газового холодового воздействия [60], а также показывает возможность ее коррекции в норме и патологии.