2. Объекты и методики исследования клеток

   1. Подготовка образцов лимфоцитов для асм исследований

Происходит забор крови у спортсменов прошедших курс криотерапии, он составляет 10 процедур по 3 мин, минус110С. Периферическую кровь из локтевой вены в объеме 10 мл (или 5 мл) забирают в вакутейнер, содержащий гепарин или ЭДТА.

Разбавляют 5 мл крови 1:2 (т.е. равным объемом) физ. раствора (ФР) или ЗФР, мягко перемешивают, переворачивая пробирку.

В 15 мл центрифужную пробирку с коническим дном (стандартный пластиковый Фалькон) наливают 3 мл раствора фиколла (плотность 1, 077 г/мл) и осторожно наслаивают на него 10 мл разбавленной крови.

Пробирки центрифугируют в течение 30 мин в бакет-роторе при 1500 тыс. обр. при комнатной температуре.

В процессе центрифугирования эритроциты и гранулоциты “проваливаются” в градиент фиколла и оседают на дно пробирки. На верхней границе градиента при правильном разделении образуется рыхлое кольцо беловатого цвета, состоящее в основном из лимфоцитов с примесью моноцитов. Над слоем лимфоцитов находится плазма.

Плазму осторожно отсасывают практически до уровня клеточного кольца.

Лимфоциты осторожно собирают пипеткой и переносят в чистую коническую центрифужную пробирку, добавляют 10 мл ФР или ЗФР, мягко перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин в бакет-роторе при 3000 тыс. оборотов при комнатной температуре.

Удаляют надосадочную жидкость отсасыванием и процедуру отмывки лимфоцитов повторяют еще один раз. Наполняем пробирки NaCl до 5мл, ресуспензируем, затем наполняем пробирки до 10 мл, так, чтобы V их был одинаков. Центрифугируем:15мин., 3000 тысяч оборотов. Отбираем всю надосадочную жидкость. На дне пробирки остаются клетки, добавляем NaCl столько сколько нужно нам для размешивания [42].

Полученную суспензию наслаиваем на предметное стекло и ждали высыхания образца. Для каждого спортсмена готовился образец препарата, содержащий клетки лимфоцитов. Каждому образцу присваивался порядковый номер и дата проведения эксперимента.

Приготовление раствора фиколла: 22 г фиколла растворяют в 240 мл дистиллированной воды в течение ночи при комнатной температуре и добавляют 44,6 мл верографина (76%). Плотность раствора контролируют с помощью поплавкового денсиметра (ареометра), она должна быть 1,077г/мл.

Примечание: фиколл растворяют изначально в немного меньшем объеме воды. После его полного растворения объем доводится водой до точной отметки. Плотность раствора можно скорректировать путем добавления небольших объемов верографина (повышение) или воды (понижение) [43].

2. Атомно-силовая микроскопия

АСМ исследования проводились на атомно-силовом микроскопе «НТ-206» («Микротестмашины», Беларусь). Обработку полученных данных осуществляли с помощью программы SurfaceExplorer («Микротестмашины», Беларусь) и программного обеспечения для расчета модуля упругости NanoFiz1.0. Эксперимент был выполнен в контактном режиме работы атомно-силового микроскопа с использованием зонда NSC 11, радиусом закругления 41 нм и жесткостью консоли 3 Н/м [44].

Исследования морфологии клеток и упругих характеристик их мембран проводились при температуре: 20°С. Данная температура была выбрана в связи с необходимостью изучения особенностей поверхности мембраны и изменения упругих характеристик клеток при данной температуре. Локальный модуль упругости клеток рассчитывали по модели Герца. Статистическая значимость различий определялась с помощью критерия Манна–Уитни, различие считалось достоверным при p<0,05.

Полученные математические данные обрабатывались в программах SurfaceExplore и Origin 60.