153.Способы введения клонируемой днк в клетки бактерий. (с помощью вирусов.)

Для введения чужеродной ДНК в клетки бактерий использу-ются два метода. Первый основан на использовании плазмиды в ка-честве вектора. Для трансформации плазмиды в бактериальную клетку, культуру клеток Escherichia coli обрабатывают солями каль-

ция и кратковременно нагревают до 42 С с последующим резким охлаждением до 0 С. Это приводит к модификации структур по-верхностного аппарата клетки, и клетки активно захватывают плаз-миды. Однако, далеко не все клетки получают плазмиду. Чтобы от-

личить трансформированные клетки от нетрансформированных, в геном плазмиды вводят гены, кодирующие устойчивость к различ-ным антибиотикам. Бактерии, имеющие такие гены, способны расти на средах содержащих соответствующий антибиотик. После завер-

шения трансформации клетки Escherichia coli помещают в чашку Петри с агаризованной средой, в которую добавлен, например, ам-пицилин. Клетки, не получившие плазмиду, и соответственно, ген устойчивости к ампицилину погибают. Клетки же содержащие

плазмиду выживают и дают начало колонии, все клетки которой со-держат плазмиды. Для того, чтобы клетки Escherichia coli случайно не утратили плазмиду, их постоянно культивируют на среде, содер-жащей антибиотик. Так как до трансформации в плазмиду был

встроен какой-нибудь ген эукариотической клетки, получается, что все бактерии такой культура его содержат.

Второй метод, которым исследователи пользуются для введе-ния гена в бактериальные клетки, основан на применении бакте-риофагов в качестве вектора. Ген, теми же методами, что и в плаз-миду, встраивают в бактериофаг. Чаще всего для этих целей исполь-зуются фаги , М13 и Х174. После этого культуру клеток Escheri-chia coli заражают фагом. Фаг проникает в клетку, используя соот-

ветствующие рецепторы, имеющиеся на поверхности клеточной мембраны. Вместе с фагом в клетку проникает и встроенный в ДНК фага ген эукариотической клетки, который реплицируется вместе с генами бактериофага при размножении последнего в клетке. Пре-

имущество использования бактериофагов вместо плазмид состоит в том, что в бактериофаг можно встроить значительно более длинный фрагмент чужеродной ДНК, чем в плазмиду. Кроме того, бактерио- фаги могут встраиваться в бактериальную хромосому и передавать-ся всем потомкам данной клетки.

154. Способы введения рекомбинантной Днк в клетки растений и животных

Способы прямого введения гена в клетку

Прямое введение гена в клетку осуществляют несколькими способами:

Трансфекция

Микроинъекция

Электропорация

Метод "мини-клеток"

Упаковка в липосомы

Электронная пушка

При трансфекции ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция (Грэхем Ван дер Эб, 1973). Образуются частицы кальциевого преципитата. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.

Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора (рис. 45). Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы (ТК) и плазмиду рВR322, были инъецированы в ТК--клетки и было показано, что ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался. Метод введения ДНК с помощью микроинъекций был разработан в начале 70-х годов Андерсоном и Диакумакосом. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.

Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют клетки и фрагменты ДНК, которые необходимо ввести в клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы приводящие к образованию пор в цитоплазматической мембране, - проходит ДНК.

"Мини-клетки" получают путем блокирования донорных клеток митозе колцемидом. При продолжительной обработке клеток колцемидом в них вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Обработка цитохалазином. В и центрифугирование приводит к образованию мини-клеток, представляющих микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану.

Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз. Липосомы - сферические оболочки, состоящие из фосфолипидов. Получают их путем резкого встряхивания смеси водного раствора и липидов, либо обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Системы переноса с помощью липосом низкотоксичны по отношению к клеткам.

Метод биологической баллистики Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама, диаметром 0,6 1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые частички, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток наносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под биолистическую пушку на расстоянии 10 15 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления вольфрамовые частички с огромной скоростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.