142. Стратегия клонирования у грамотрицательных бактерий.

Векторы для клонирования в таких системах представляют < бой двойные репликоны, способные существовать ив Е. coli, ] той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой 1 лью создают гибридные векторы, содержащие репликон какс либо из плазмид Е. coli и требуемый репликон (из бактерий, дро жей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбор требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем выделены рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм. Такие в< торы должны содержать ген (или гены), придающий клетке-хо: ину легко тестируемый признак.

В. subtilis — непатогенный почвенный микроорганизм. Клеи ная стенка бактерии имеет простую структуру, позволяющую а ретировать многие белки в культуральную жидкость. В частное 20 различных видов бактерий синтезируют более 40 фермент© внеклеточной локализацией. В этих бациллах обнаружены плазь ды и фаги, генетика которых хорошо изучена. Клонирование а ществляется с помощью так называемых челночных векторов, торые способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев: subtilis, Е. coli, Staphylococcus aureus. Векторы были получены кс бинацией in vitro фрагментов плазмид St. aureus, Е. coli и хро» сомных фрагментов В. subtilis. Полученные рекомбинантные iirrt мы несут признаки устойчивости к антибиотикам.

Интегрирующая плазмида pFH7 получена путем объединения 2 репликонов, один из которых берет начало от плазмиды pC194 B.subtilis, а другой от плазмиды pBR322 E.coli, что дает возможность вектору существовать стабильно реплицироваться как в клетках B.subtilis, так и E.coli. Такие векторы, способные реплицироваться в клетках-хозяевах разных биологических видов, называют челночными или бинарными. Принципы конструирования и функционирования челночных векторов одинаковы, они должны включать в себя репликоны тех генетических систем, в которых будет происходить репликаця челночного вектора.

Примерами челночных векторов являются плазмидные ДНК, способные реплицроваться в клетках высших (жив. и растений) и низших организмов. Необходимость использования челночных векторов в генной инженерии связана с тем, что наработку в препаративном количестве векторной ДНК для проведения генно-инженерных манипуляций удобно проводить в бактериальных клетках, тогда как получение биологически активных продуктов клонированных генов высших организмов во многих случаях возможно только в клетках своего или близкого вида, в которых эти гены экспрессируются в природных условиях, т.е. в своем обычном генетическом окружении.

143. Стратегия клонирования в грамположительных бактериях

В наст.время разработаны стратегии клонирования в бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения пр-т системы клонирования в грамположительных бактериях, многие из которых являются сверхпродуцентами важнейших химических соединений. Значительных успехов в биоиндустрии удалось достичь с клетками B.subtilis, стрептомицетами и Saccharomyces cerevisiae. Векторы для клонирования в таких системах пр-т собой двойные репликоны, способные существовать и в клетке E.coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-л из плазмид E.coli и требуемый репликон (из дрожжей, бактерий и др.) и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем выделенные рекомбинантные вводят в новый организм. Такие векторы должны содержать ген (или гены), придающей клетке-хозяину легко тестируемый признак.

B.subtilis- непатогенный почвенный микроорганизм. Клеточная стенка бактерии содержит простую структуру, позволяющую секретировать многие белки в культуральную жидкость. В частност, 20 различных видов бактерий синтезирует более 40 ферментов с внеклеточной локализацей. В этих бациллах обнаружены плазмиды и фаги. Клонирование осущетвляется с помощью челночных векторов, которые способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев: B.subtilis, E.coli. Векторы были получены комбинацией in vitro в пробирке фрагментов плазмид E.coli и хромосомных фрагментов B.subtilis. Полученные рекомбинантные штаммы несут прзнаки устойчивости к антибиотикам.

Стрептомицеты широко применяют в биотехнологии в качестве продуцентов антибиотиков. Конструирование векторов для клонирования в них началось с выделения плазмиды Scp22 из Streptomyces coelicolor. На основе этой плазмиды были сконструированы векторы, придающие стрептомицетам устойчивость к антибиотикам, например к метиломицину А.