138. Использование вирусных геномов в качестве векторов для введения генетической информации в клетки животных

Т.к у эукариот (животных) не обнаружено ядерных плазмид, то единственными «донорами» для переноса векторов могут быть вирусы. Вирусы животных плохи для использования потому что:

1. В их геноме нету несущественных областей, которые можно было бы заменить клонированной ДНК. => векторы сконструированные на базе таких вирусов дефектны.

2. Емкость вирусных векторов ограничена, т. к в капсид может упаковываться лишь определённое кол-во ДНК( а гены эукариот очень большие 30 и > пар нуклеотидов).

Вирус SV-40.

Развиваются в клетках обезьяны. Т. к он обладает онкотрансформирующим действием и может нарушить структуру генов, его редко используют для интеграции клонированных генов в клеточные хромосомы. С помощью таких векторов можно наблюдать экспрессию.

Вирус осповакцины.

Обладает двунитевой ДНК, которая имеет уникальное строение. Это линейная молекула на обоих концах которой имеются шпильки, замыкающие ковалентно обе нити ДНК. Привлекателен в качестве вектора, т к:

1. имеет широкий спектр клеток-хозяев. От беспозвоночных до позвоночных.

2. Позволяет внедрять большие фрагменты чужеродной ДНК ( до 25 т п н.), у самого вируса геном 187 т. п. н..

3. Безопасен для использования.

Их используют для создания рекомбинантых вирусов, в геном которых встроены гены кодирующие белки-антигены различных болезнетворных вирусов (микробов), создавая при этом иммунитет к инфекционным заболеваниям.

Ретровирусы.

Обладают однонитевой РНК. Их жизненный цикл обязательно проходит через образование двуцепочечной ДНК. Преимущества:

1. Исключительно широкий круг хозяев.

2. Структура интегрированной ДНК исключает возможность перестройки клонированного в ней гена.

3. Клетки не погибают, а продуцируют вирусы в течение многих генераций.

Так же используют:

- аденовирусы;- бакуловирусы ( инфицируют насекомых).

139.Свойства вируса sv40 и векторов на его основе.

Вирус SV40 (сокращение от Simian vacuolating virus 40) — полиомавирус, обнаруженный в клетках обезьяны и человека. Как и другие полиомавирусы, SV40 является ДНК-содержащим вирусом. Вирус SV40 имеет икосаэдрический вирион, содержащий геномную ДНК длиной около 5000 пар оснований. Вирион прикрепляется к рецепторам MHC класса 1 на поверхности клетки при помощи гликопротеина VP1. Внутри ядра клетки клеточная РНК полимераза II экспрессирует ранние гены. Транскрибированная мРНК подвергается разрезанию на два фрагмента, кодирующие большой и малый Т-антигены. Около 5 % большого Т антигена поступает в плазматическую мембрану клетки, а около 95 % поступает в ядро. В большой Т антиген связывается с тремя сайтами в вирусной ДНК, связывание с сайтом I и II регулирует синтез ранних РНК, связывание со вторым сайтом происходит в каждом клеточном цикле II. Связывание с сайтом I вызывает репликацию ДНК в месте ориджина репликации. Сборка вирионов осуществляется в ядре клетки. Из-за насыщенности генетической структу-

ры вируса SV40 лишь в ограниченном числемест на его ДНК могут происходить незначи-тельные перестройки типа вставок или делецийбез потери жизнеспособности вируса. Привстройке в ДНК данного вируса чужеродногофрагмента по любому из уникальных мест гид-ролиза рестриктазами будет происходить нару-шение той или иной функции),т. е. гибридные вирусы SV40 будут дефектны.

Чтобы гибридная ДНК могла упаковаться в вирусный капсид, ее размер должен составлять70-100 % генома вируса. Поэтому для получе-ния гибридного вирусного потомства необходи-мо чужеродный фрагмент ДНК встраивать в мо-лекулу вирусной ДНК, у которой предваритель-но с помощью рестриктаз делетирован опреде-ленный район. Такие векторы являются векто- рами замещения. Обязательное условие приконструировании гибридных вирусов — сохра-нение неповрежденной области начала репли-кации вирусной ДНК. Нарушенные при встрой-ке в векторную ДНК другие вирусные функциинеобходимо комплементировать с помощью ви-руса-помощника. Молекулярные векторы дан-ного типа на основе ДНК вируса SV40 называ-ют литическими векторами.Векторы на основе SV40 редко используют для переноса клонир. Генов в клетки хромосом.