136.Векторные системы для клонирования в клетках дрожжей:

Клонирование в дрожжах. Среди дрожжей наиболее полно и чен вид S. cerevisiae. У этого вида в гаплоидных клетках содержи 17 хромосом, в их составе идентифицировано несколько сой генов. Большинство штаммов дрожжей содержат автономно р| лицирующуюся кольцевую ДНК длиной 2 мкм. Плазмида Scp| cerevisiae содержит около 6300 пар оснований и имеет 50—г^ копий на клетку. Ее гибриды с плазмидами обычно и используют в качестве векторов. Работа с дрожжами облегчается тем, что подоб­но бактериям они могут расти в жидкой среде и давать колонии на твердой среде, а такие имеют сравнительно короткое время реге­нерации (несколько часов) вследствие малого размера генома.

Процедура выделения ДНК в клетки дрожжей довольно про­ста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, получая так называемые сферопласты. Их инкубиру­ют с ДНК в присутствии СаС12 и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкуба­ция сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных реком- бинантными плазмидами, основана на применении в качестве клеток-хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, в которой отсутствует тот или иной питательный компо­нент. Векторная плазмида содержит гены, которые при попада­нии в клетку-хозяина придают ей этот недостающий признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать коло­нии на обедненной среде. Применяя приемы, аналогичные ис­пользовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Эти клетки по­добно В. subtilis секретируют большое количество белка во вне­клеточную среду, что используется также для секреции чужерод­ных белков, например интерферона человека.

Известны 5 типов дрожжевых векторов: YIp – не способны реплицироваться в дрожжевых клетках, но осуществляют их трансформацию путём интеграции в гомологичный участок хромосомы путём двойного кроссинговера. Сконструирован на основе плазмиды ColEI и маркера Leu2.

Вектор YEp. Состоят из плазмиды pBR322, репликатора 2-микронной плазмиды и дрожжевого селективного маркера. Для поддержания вектора в дрожжах являются сайты ori и STB 2-микронной плазмиды. Маркирован LEU2.

Вектор YRP. Имеют хромосомные репликаторы ARS. Способен к автономной репликации. Нестабилен. Применяется когда появляется необходимость иметь умеренное число копий клонируемого гена.

Вектор YCp – кроме хромосомных репликаторов содержат центромеры дрожжевых хромосом. Проявляет стабильность при митозе и мейозе. Хотя и меньшую, чем ествественные хромосомы. В процессе мейоза вектора сегрегируют по Менделю, с образованием кольцевых мини-хромосом.

Вектор YLp – создан на базе вектора YRp путём их линеаризации и присоединения к концам теломер взятых из внехромосомной линейной рДНК ресничной инфузории. Вектор использовали для клонирования дрожжевых теломер и анализа их структуры.

137.Генетическая инженерия эукариотических микроорганизмов. Сахаромицеты как базовый организм.(136)

E. Coli – удобная система для экспериментов на прокариотах. Для эукариотических клеток данные системы не подхядят, т к эукариотические клетки обладают специфическими функциями( митоз, мейоз, дифференцировка). Для исследования растительных или животных белков лучше использовать родственные клетки. Но в ряде случаев можно использовать простые для культивирования дрожжевые клетки.

Дрожжевые клетки удобны как продуценты, проявляют высокую генетическую стабильность, не подвергаются фаголизису, не выделеяют токсины.

Для клонирования хорошо зарекомендовали себя S. Cerevisiae. Их геном состоит из 16 хромосом и полностью секвенирован. Содержит 6000 генов. ДНК больше в 3 раза, чем у бактерий.

Экспрессия чужеродных генов может быть функциональной и нефункциональной. В случае функциональной экспрессии чужеродные белки в условиях in vivo проявляют свою активность. Для клонирования фрагментов ДНК в дрожжевых клетках как правило используют челночные векторы: гены можно клонировать в E. Coli, а затем исследовать их экспрессию в дрожжевых клетках. Из дрожжевых клеток трудно выделить значительное количество векторных молекул. Эту процедуру проводят в 2 этапа. Сначала выделяют суммарную ДНК, а затем трансформируют ей E. Coli отбирают клоны по селективным признакам.

Для трансформации дрожжи делают:

1). Плазмида вводится в протопласт. Протопласты получают с помощью бета-гликозилаз (удаляют клеточные стенки). Сорбитол – предотвращает осмотического шока протопластов. Далее протопласты с трансформированной ДНК инкубируют с этиленгликолем и хлористым кальцием. И высевают на твёрдые селективные среды. Там происходит регенерация клеточных стенок и образование колоний трансформантов. Полиэтиленгликоль способствует слиянию протопластов.

2). Трансформация целых клеток обрабатываемых 0,1 м ацетатом лития в присутсвии этиленгликоля. Данный метод проще, но эффективность ниже.

3). Электропорация.