128.Космиды и их применение

Космиды — это плазмидные векторы, в ко-торые встроен участок генома фага Я, обеспечи-вающий возможность упаковки этой молекулы

ДНК в фаговую частицу. Необходимыми компо-нентами космидного клонирующего вектора яв-ляются:

• плазмидный участок начала репликацииДНК и детерминанта устойчивости к анти-биотику;

• единичное число мест гидролиза одной илинесколькими рестриктазами, пригодныхдля клонирования фрагментов ДНК;

• фрагмент ДНК, содержащий ковалентно за-шитые липкие концы фага Я (cos-сайт).

Кроме того, космида должна иметь неболь-шой размер, чтобы можно было клонироватьфрагменты ДНК длиной более 30 тпн. приведен на рис. 2.20. Лигированию подверга-

ется смесь молекул космидной и клонируемойДНК, гидролизованных определенной рестрик-тазой. При этом космида находится в высокойконцентрации. Среди большого многообразияпродуктов лигазной реакции образуются также

молекулы, состоящие из клонируемых фраг-ментов ДНК, к обоим концам которых пришитыкосмиды так, что оба cos-сайта находятся в оди-

наковой ориентации и между этими cos-сайта-ми сосредоточена вся генетическая информа-ция космиды. Когда такие молекулы инкубируют в реак-

ции упаковки ДНК фага Я in vitro, cos-сайты,фланкирующие чужеродную ДНК, расщепля-ются фаговыми ферментами с образованием од-

ноцепочечных липких концов, и получившиесямолекулы ДНК упаковываются в фаговые кап-сиды. После инфекции клеток Е. coli образовав-

шимися in vitro фаговыми частицами гибрид-ные ДНК внедряются в клетки, циклизуются полипким фаговым концам, реплицируются какплазмиды и детерминируют устойчивость к оп-ределенному антибиотику. В процессе упаков-ки гибридных ДНК in vitro происходит отборгибридов, суммарный размер ДНК которых со-

ставляет 38-51 тпн. Наиболее популярные кос-мидные векторы имеют размер 4-6 тпн, поэто-му в них ожно клонировать фрагменты ДНК длиной от 35 до 45 тпн.

Космиды-это плазмиды,несущие соs участок(липкие концы).Наличие соs участка позволяет произодить упаковку ДНК в головку фага in vitro.Таким образом ,космиды могут быть введены в клетку не с помощью трансформации,а путём обычной инфекции.Космиды-векторы с наибольшей емкостью, и поэтому они специально предназначены для клонирования больших фрагментов эукариотической ДНК и создания клонотек геномов.После инфекции рекомбинантная ДНК с помощью липких концов фага замыкается в кольцо и поддерживается в клетке как плазмида за счёт области космиды,ответственной за репликацию(оri)

129. Упаковочная система фага лямбда.

Для фага X, часто используемого в качествемолекулярного вектора клеток Е. coli, разрабо-тан метод упаковки ДНК in vitro в капсиды. Дляэтого требуются концентрированные экстрактыклеток, индуцированных из лизогенного состоя-ния. Используются мутанты фага, имеющие де-фекты по разным генам белков головки капсида.Каждый из таких мутантов не способен образо-вывать полноценные фаговые частицы и упако-вывать свою ДНК. При смешении же фаговойДНК и белковых экстрактов клеток, в которыхразвивались мутанты, происходит комплемен-тация недостающих функций и собираются ин-фекционные частицы. Биологическую актив-ность эндогенной фаговой ДНК в экстрактахобычно подавляют УФ-облучением. Сформированными in vitro частицами мож-но заражать клетки Е. coli и получать фаговоепотомство. Эффективность упаковки ДНК фа-га Я in vitro обычно составляет 10~2—10~3.

Важной особенностью данного подхода яв-ляется то, что в капсид преимущественно упа-ковываются молекулы фаговых ДНК, имеющиеразмер, близкий к размеру фагового генома. Этопозволяет после реакции лигирования фрагмен-тов осуществлять селекцию гибридных моле-кул ДНК in vitro по размеру. Кроме того, в кап-сиды не упаковываются многочисленные по-бочные продукты лигазной реакции. Поэтомуобразовавшиеся после упаковки фаговые части-цы инъецируют в бактериальные клетки лишьфаговые ДНК заданного размера. При клониро-вании фрагментов в векторных молекулах ДНКфага X обычно используют именно этот методвведения гибридных ДНК в клетку. Данный при-ем также необходим при клонировании фраг-ментов ДНК в составе космид и фазмид.

Фаговая частица бактериофага λ имеет головку, в которой заключена плотно упакованная ДНК длиной примерно 50 т. п. н., и отросток с отходящими от него тонкими белковыми нитями (фибриллами). Сборка головки и отростка и упаковка ДНК четко скоординированы. ДНК фага λ — это линейная двухцепочечная молекула длиной 50 т. п. н. с одноцепочечными 5'-«хвостами» из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos) концами, поскольку они взаимно комплементарны и могут спариваться друг с другом. После того как фаговая ДНК проходит через отросток и попадает в E. coli, cos-концы соединяются с образованием кольцевой молекулы. На раннем этапе литического цикла в результате репликации кольцевой молекулы ДНК образуется линейная молекула, состоящая из нескольких сегментов длиной 50 т. п. н. Каждый из таких сегментов упаковывается в белковую головку, к последней присоединяется уже собранный отросток и образуется новая фаговая частица. При упаковке молекулы ДНК длиной менее 38 т. п. н. получается неинфекционная фаговая частица, а фрагменты длиной более 52 т, п. н. не умещаются в головку. Сегменты длиной 50 т. п. н. в линейной молекуле ДНК разделены cos-сайтами, и именно по этим сайтам разрезается молекула, когда очередной сегмент заполняет головку. Разрезание осуществляет фермент, находящийся у входа в головку. В результате исследований по изучению сборки фага λ была разработана система упаковки молекул ДНК in vitro с образованием инфекционных фаговых частиц. Смешав в пробирке очищенные пустые головки, фаговую ДНК и собранные отростки, можно получить инфекционные фаговые частицы.