126.Фаг л и векторы, сконструированные на основе его генома.

В зрелых вирионах фага Я ДНК находитсяв виде двухцепочечной линейной молекулы раз-мером 48 502 пн. На концах молекулы ДНКимеются взаимокомплементарные GC-обога-

щенные одноцепочечные концы длиной 12 нук-леотидов (обозначаются как cosR. и cosh). Сразупосле попадания в клетку фаговая ДНК цикли-зуется по этим концам и функционирует в клет-

ке в кольцевой форме. Район ковалентно заши-тых cosR и cosh называется cos-сайтом. Фаг Яявляется умеренным фагом, т. е. в зависимостиот условий может развиваться в клетке либо по

литическому, либо по лизогенному пути.При литическом развитии происходит лизисклеток и образуются инфекционные фаговыечастицы, при лизогенном молекула ДНК фага Я

интегрируется в бактериальную хромосомупреимущественно в одно место между генамиgal и Ыо и находится в так называемом состоя-нии профага. Штамм, лизогенный по какому-

либо умеренному фагу, обозначается следую-щим образом: за обычным наименованием бак-териального штамма в круглых скобках указы-вается лизогенизирующий фаг, например, Е. co-

li С600(Яс1 7). Получение векторных молекул на основеДНК фага Я сводится к введению мутаций поучасткам действия рестриктаз в существеннойдля размножения фага области генома с сохра-нением их в несущественной области. Посколь-ку клетки Е. coli, обладающие системой рест-рикции-модификации EcoRl, пермиссивны дляфага Я, именно для рестриктазы EcoRl былиполучены первые векторные фаги Я. Это обус-ловлено тем, что мутанты фага Я по местамдействия рестриктазы EcoRl можно достаточнопросто получать и отбирать в системе in vivo.

Схема данного подхода состоит в следующем.Фагом Я попеременно инфицируют клеткиЕ. coli, имеющие систему рестрикции-модифи-кации EcoRl и не имеющие таковой. Возникаю-

щие спонтанно или в результате мутагенеза му- танты, потерявшие некоторые из участков дейст- вия рестриктазы, имеют селективное преимуще-

ство перед исходным фагом при размножении на штамме с системой рестрикции-модификации, так как мутантный фаг с большей вероятностью

выживает на рестриктирующем штамме за счет конкурентной модификации имеющихся на ДНК мест рестрикции. Существующие в настоящее время вектор-

ные фаги Я для каждой конкретной рестриктазы делят на векторы внедрения и векторы замеще- ния. Векторы внедрения имеют на ДНК одно

место действия для данной рестриктазы. Если при встройке экзогенного фрагмента ДНК в этот сайт происходит нарушение какого-либо

гена исходного фага, селекция гибридных кло- нов осуществляется как выявление соответст- вующих фаговых мутантов. Рассмотрим типич-Векторы замещения имеют два или боль-

ше мест действия рестриктазы на молекуле фа-говой ДНК. Заключенные между этими участ-ками фрагменты векторной ДНК замещаютсядонорными фрагментами ДНК. При этом про-

исходит делеция ряда генов фага, что детекти-руется соответствующими генетическими ме-тодами.

127 Фазмиды и их применение

При выполнении определенного типа экспе-риментов по созданию и изучению геномныхклонотек удобно использовать фазмиды — мо-лекулярные векторы, являющиеся искусствен-ными гибридами между фагом и плазмидой.Фазмиды после встройки чужеродной ДНК мо-гут в одних условиях развиваться как фаги,а в других как плазмиды. Максимальный размер фрагментов ДНК,которые можно клонировать в фазмидах, обыч-но несколько меньше допустимой величинывстройки для векторов на основе ДНК фага Я(этот размер легко высчитать, зная величинувектора; см. 2.2.2). Фазмиду выделяют из кле-ток в виде плазмиды, гидролизуют определен-ной рестриктазой и лигируют с продуктаминеполного гидролиза изучаемой ДНК, после че-го проводят упаковку ДНК в капсиды фага Я. Фазмиды имеют важные преимущества пе-ред векторами других типов, используемымидля создания библиотек генов. В отличие отвекторов замещения фага Я нет необходимостиотделять векторную молекулу ДНК от внутрен-него балластного фрагмента, что существенноупрощает процедуру подготовки векторак встройке чужеродной ДНК. Более того, этообеспечивает практически полное отсутствие

у фазмиды «фоновых» гибридов, которые обыч-но образуются у фаговых векторов, так какочень сложно полностью избавиться от заме-щаемого внутреннего фрагмента. В отличие откосмид фазмида типа ApMYF131 после лигаз-ной обработки не способна упаковывать в фаго-вые частицы свои димерные и тем более муль-тимерные формы, поскольку даже димер пре-вышает по размеру фаговую ДНК, способнуюк упаковке. Поэтому при использовании фаз-мидного вектора не требуются дополнительныеферментные обработки, которые обычно необ-ходимы для космид. Таким образом, применение фазмидныхвекторов упрощает процедуру получения и от-бора гибридных молекул ДНК, так как толькогибридные фазмиды могут образовывать набактериальном газоне фаговые бляшки. В отли-чие от космидной или фаговой векторных сис-тем фазмидный вектор существует в клеткев виде плазмиды, а клонотека получается и хра-нится в виде суспензии гибридных фагов. дляЛр]УП(Т131 —термоиндукция). Таким обра-зом, фазмиды являются векторами, обеспечи-

вающими возможность смены фаз, т. е. экспери-ментально регулируемого переключения разви-тия гибридных ДНК на фаговый или плазмид-ный путь.

Истинными гибридами плазмиды ( стабильно наследуемые внехромосомные генетические элементы)и фага являются фазмиды (молекулярные векторы)- линейные дуплексные молекулы ДНК, на концах которых расположены сегменты ДНК фага λ, содержащие все гены, требующиеся для литической инфекции, а ср.часть предст-на линеаризованной плазмидой. Т.е фазмиды содержат cos-сайт + плазмидные элементы. Также исп-ся для созданя банка генов. Ф-ции репликации как фага, так и плазмиды в фазмидах полностью сохранены. Обычно такие векторы содержат неск-ко тандемных повторов плазмидной части, обеспеч-х необходимую для упаковки ДНК протяженность генома.1 или несколько плазмидных повторов пр конструировании рекомб-х ДНК заменяют соответствующей вставкой.

Фазмидные ДНК перед инфицрованием упаковывают in vitro в фаговые головки. Попадая в клетку E.coli,фазмда реплицируется как фаговая ДНК, в рез-те чего на газоне чувствительных клеток образуются бляшки. Однако, если вектор содержит ген, кодирующий репрессор фага λ , то фазмида реплицируется как плазмида, а не как фаг. Существуют плазмиды, которые несут ген репрессора, кодирующего мутантный белок cI, инактивирующийся при повышю темпеатуре- температурочувствительный репрессор. В этом случае фазмида реплицируется, как плазмда пр низкой температуре и как фаг= при повышении температуры на несколько градусов.

((M13, f1, бактериофаг (одноцеп.ДНК) – адсорбируются на верхушке половой пили, через пил проникают в клетки (вирулентные). Репликация: у них +ДНК (информ, смысловая). На ней синтезируется 2 цепь- по тета типу.)