119. Специализированные векторные системы

Для экспрессии, секвенирования, интеграции хромосом. Для кажд случ разные.

специализированные векторы (секвениро-вание и мутирование генов, изучение особенностей регуляции клонированных генов, идентификация в клонируемой ДНК про-

большинство векторов носит специализированный характер, т. е. их приспосабливают для решения узкого круга задач. Например, векторы, предназначенные для экспрессии генов, содержат около сайтов клонирования мощные промоторы, причем экспрессия может быть регулируемой или нерегулируемой (конститутивной). Присутствие в таких векторах специальных сигнальных последовательностей обеспечивает секрецию продуктов клонируемых генов. Малокопийные векторы позволяют изучать, например, механизмы регуляции клонируемых генов, а мультико-пийные способны умножать (амплифицировать) их число в сотни и тысячи раз. Разработаны векторы для секвенирования нуклео-тидных последовательностей и для поиска в них определенных регуляторных сигналов — промоторов, терминаторов транскрипции, антитерминаторов и т. д. Векторы прямой селекции позволяют выживать только таким трансформантам, которые содержат рекДНК.

120.Векторные системы,применяемые применяемые при молекулярном клонировании в клетках прокариотических организмов:

Первые векторы для клонирования фрагментов чужеродной ДНК были получены с использованием бактериальных плазмид. Большая серия векторных плазмид, обозначенных символом pBR , создана на основе репликона природной плазмиды ColEI , придающей клеткам E. coli устойчивость к колицину путем его объединения с генами устойчивости к антибиотикам. Бактериальные клетки, несущие подобные комбинированные плазмиды, приобретали устойчивость к соответствующим антибиотикам, и их было легко отличить от бесплазмидных клеток путем простого посева на питательную среду с антибиотиками.

Векторы серии pBR322

Плазмида представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую молекулу ДНК длиной 4363 п.о. Плазмида содержит гены устойчивости к тетрациклину (Tc) и ампициллину (Ap) , которые были перенесены в плазмиду pBR322 из плазмиды pSC101 и транспозона Tn3 соответственно. Оба этих гена являются селектируемыми генетическими маркерами плазмиды, т.е. позволяют проводить отбор бактериальных клеток с плазмидой pBR322 по их способности к росту на питательных средах в присутствии тетрациклина и (или) ампициллина.

Плазмида pBR322 содержит обеспечивающий ее стабильную репликацию в клетках E. coli участок ДНК, который включает область начала репликации (ori). В плазмиде pBR322 имеются несколько уникальных сайтов рестрикции. Встраивание в плазмиду клонируемых чужеродных фрагментов ДНК по сайтам рестрикции, расположенным в генах Ар или Tc (например, PstI или BamHI ), будет нарушать целостность этих генов и их функциональную активность. В результате происходит утрата бактериальными клетками, содержащими рекомбинантные плазмиды, устойчивости к соответствующим антибиотикам. По такому признаку легко различить бактериальные клетки, не содержащие плазмиды (не растут в присутствии ампициллина и тетрациклина), клетки с плазмидой, не содержащей вставки клонируемой ДНК (растут в присутствии обоих антибиотиков), и клетки с рекомбинантными плазмидами (в зависимости от локализации вставки могут расти на среде только с одним антибиотиков).