105.Способы «нарезания» фрагментов днк.(104).

Несколько способов «нарезания» в основанном с участием рестриктаз. Одна из первых рестрицирующих эндонуклеаз типа II была выделена из бактерии Escherichia coli и получила назваие EcoRI. Этот фермент узнает участок ДНК, содержащий специфическую палиндромную последовательность (последовательность-перевертыш, идентичную в обеих цепях при прочтении в направлении 5'-->3') из шести пар оснований и вносит разрыв между остатками гуанина и аденина в каждой цепи, расщепляя связь между атомом кислорода при 3'-атоме углерода сахарного остатка одного нуклеотида и фосфатной группой, присоединенной к 5 '-углеродному атому сахарного остатка соседнего нуклеотида. Разрывы в цепи ДНК располагаются наискось друг от друга, в результате чего образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из четырех нуклеотидов в каждом (липкие концы). Каждый одноцепочечный «хвост» заканчивается 5'-фосфатной группой, а 3'-гидроксильная группа противоположной цепи как бы утоплена. Помимо EcoRI, из бактериальных клеток были получены сотни рестрицирующих эндуклеаз типа II. Палиндромные последовательности, которые распознаются рестрицирующими эндонуклеазами типа II и в которых происходит расщепление молекулы ДНК, называются сайтами узнавания. Помимо рестриктаз, гидролизующих (расщепляющих) полинуклеотидную цепь с образованием липких концов, существуют рестриктазы, которые вносят разрывы в цепи строго друг против друга с образованием фрагментов ДНК с «тупыми» концами (рис. 4.3). Сайты узнавания могут состоять из четырех, пяти, шести, восьми или более пар нуклеотидов (табл. 4.1). От длины сайта узнавания зависит частота его распространения в молекуле ДНК; в большинстве случаев используют рестриктазы, узнающие тетра- и гексануклеотиды. Рестрицирующие эндонуклеазы типа II играют ключевую роль при генном клонировании. Обработка образца ДНК определенной рестриктазой всегда дает один и тот же набор фрагментов — при условии, что расщепление происходит по всем сайтам узнавания. Если использовать несколько ферментов рестрикции и сначала обработать ДНК каждой из рестриктаз в отдельности, а затем их комбинациями, можно построить физическую карту данной ДНК, т. е. установить порядок следования сайтов рестрикции вдоль молекулы. Определив размер полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза, можно найти положение рестрикционных сайтов.

106. Способы идентификации фрагментов днк.

Идентифицируют при помощи зондов. Зонд – одноцепочечная молекула Рнк , комплементарная участку этой Днк. (гибрадная . т.к. содержит и ДНК и рнк)

Как получают: берут ДНК , денатурируют до одноцепочечной молекулы, добавляют в среду зонд, его обычно радиоктивно метят. Разгоняют в геле электрофорезом и переносят на мембрану. Далее к мембране прикладывают пленку для проявления и проявляют ее . Если на ней есть пятна, значит ген есть.

По экспрессии (Erwinia, слой пектина, лизирование, лунки, отбирал клоны(Евтушенко) in vivo. И по экспрессии ( не фенотипический) – антигены, антитело: пятно, если синтезируют.

107.Требование к базовым штаммам в генной инженерии.

Для того чтобы осуществить генно-инженерный эксперимент, т. е. создать рекомбинантную ДНК и ввести ее в клетку другого организма, необходимо соблюсти следующие условия:

• иметь инструменты для разрезания молекул ДНК на фрагменты;

• иметь инструменты для соединения фрагментов ДНК, выделенных из различных источников;

• подобрать переносчик, или вектор генов, предназначенных к введе-нию в клетку другого организма. Этот вектор должен самостоятельно реплицироваться в клетке и обеспечивать репликацию введенного фраг-мента ДНК;

• разработать способ введения гибридных или рекомбинантных мо-лекул ДНК в живую клетку;

• определить метод отбора (селекции) клона реципиентной клетки, воспринявшей гибридную молекулу ДНК.

Самыми удобными векторами являются плазмиды, так как они, во-первых, способны реплицироваться независимо от хромосомной ДНК бактерий. Во-вторых, плазмиды содержат гены, благодаря которым по фенотипу можно отделить бактерии, содержащие плазмиды, от бактерий,

лишенных плазмид. Например, R-плазмиды содержат структурные гены, ответственные за устойчивость к антибиотикам.

Гр- Э.Коли – К-12

- наиболее изученные в физ. И генетич. Отношении

-открыта с-ма ген анализа путем конъюгации и трансдукции

-сконструированы векторы: на основе фагов и плазмид

-непатогенны

Гр+ Б.Субтилис.

-непатогенны

-преимущества: высокая метоболическая активность

-обладают системой секреции из-за строения клеточной стенки