
- •Дипломна робота бакалавра
- •2.2.3. Флуориметричне вимірювання сіалідазної (нейрамінідазної) активності IgG і (Fab)2 30
- •1. Огляд літератури
- •1.1. Аутологічні антитіла, їх продукція та характеристики
- •1.2. Функціональна активність аутоантитіл у нормі та при аутоімунних захворюваннях
- •1.3. Аутоімунні захворювання
- •1.3.1. Системний червоний вовчак – системна імунопатія
- •1.3.2. Розсіяний склероз
- •1.4. Антитіла із каталітичною ензимоподібною активністю – абзими
- •Полісахарид-гідролізуючі абзими;
- •Абзими, що володіють сіалідазною активністю.
- •1.5. Роль процесів сіалування/десіалування у функціонуванні імунної системи
- •1.5.1. Структура та функції сіалових кислот
- •1.5.1.1. Структура сіалових кислот
- •1.5.1.2. Значення сіалових кислот для функціонування імунної системи
- •1.5.2. Вплив процесів сіалування-десіалування на структуру та функції імуноглобулінів
- •1.5.3. Анти-сіалільні антитіла у нормі та при патології
- •1.5.3.1. Абзими, що володіють сіалідазною активністю
- •2. Матеріали і методи досліджень
- •2.1. Реактиви і матеріали
- •2.2. Методи досліджень
- •2.2.1. Очищення антисіалільних IgG-антитіл із сироватки крові хворих на счв та рс
- •2.2.2. Одержання (Fab)2 антисіалільних IgG-антитіл із сироватки крові хворих на счв
- •2.2.3. Флуориметричне вимірювання сіалідазної (нейрамінідазної) активності IgG і (Fab)2
- •2.2.4. Визначення сіалідазної (нейрамінідазної) активності IgG після ренатурації із пааг
- •2.2.5. Інгібування сіалідазної активності антисіалільних IgG-антитіл інгібіторами клітинних сіалідаз
- •2.2.6. Електрофоретичне розділення білків у пааг.
- •3. Результати досліджень та їх обговорення
- •3.1. Виділення та очистка IgG із сироватки крові хворих на счв та визначення їхньої сіалідазної активності
- •3.2. Виділення та очистка антисіалільних IgG-антитіл із сироватки крові хворих на счв
- •3.3. Дослідження сіалідазної активності та субстратної специфічності антисіалільних IgG-антитіл
- •3.4. Інгібування сіалідазної активності антисіалільних IgG-антитіл
- •3.5. Визначення сіалідазної активності антисіалільних IgG-антитіл, ренатурованих з пааг
- •3.6. Одержання (Fab)2 антисіалільних IgG-антитіл
- •3.7. Визначення сіалідазної активності (Fab)2 антисіалільних IgG-антитіл
- •3.8. Дослідження сіалідазної активності антитіл сироватки крові хворих на розсіяний склероз
- •4. Охорона праці Вступ
- •4.1. Аналіз стану умов праці
- •4.1.1. Характеристика лабораторії
- •4.1.2.Аналіз методів дослідження та характеристика обладнання
- •4.1.3. Характеристика об'єкту дослідження, речовин, їхніх небезпечних властивостей
- •4.2. Організаційно–технічні заходи
- •4.2.1.Організація робочого місця і роботи
- •4.2.2. Санітарно–гігієнічні вимоги до умов праці
- •4.2.3. Заходи щодо безпеки під час роботи з обладнанням, об'єктом дослідження і речовинами
- •4.3. Безпека у надзвичайних ситуаціях
- •4.3.1. Протипожежні та проти вибухові заходи
- •4.3.2. Організація евакуації працівників
абзими, що володіють протеїнкіназною активністю;
абзими, що володіють ліпідкіназною активністю;
нуклеотид-гідролізуючі абзими;
протеїн-гідролізуючі антитіла (протабзими);
ДНК-гідролізуючі антитіла (ДНК-абзими);
Полісахарид-гідролізуючі абзими;
Абзими, що володіють сіалідазною активністю.
1.4.1. Абзими, які володіють протеїнкіназною активністю. При дослідженні протеїнкіназної активності молока клінічно здорових жінок виявлено, що електорофоретично гомогенні sIgA фосфорилють казеїн молока людини по залишках серину. У наступних роботах з’ясовано, що крім казеїну, IgA-абзими можуть фосфорилювати й інші білки молока, а також, за певних умов, здатні до аутофосфорилювання. Крім препаратів sIgA молока людини, казеїнкіназну активність також було виявлено в електрофоретично гомогенних препаратах мономерного IgA, очищеного з плазми крові клінічно здорових людей [4, 22, 65].
1.4.2. Абзими, які володіють ліпідкіназною активністю. Ліпідкіназну активність sIgA вперше виявлено під час аналізу продуктів фосфорилювання фракцій sIgA, отриманих хроматографією на протеїн А-сефарозі. Необхідно відзначити, що ліпідкіназну активність було виявлено і у фракції IgG, виділеній із сироватки крові хворих на системний червоний вовчак [4, 27].
1.4.3. Нуклеотид-гідролізуючі абзими молока людини. Нуклеотид-гідролізуючу активність АТ було вперше виявлено у sIgA, однак вона також притаманна IgG молока людини [4].
1.4.4. Протеїн-гідролізуючі АТ (протабзими). Абзими, які володіють протеазною активністю, отримали назву протабзимів [4, 16, 23, 34]. Поряд із АТ, виділеними з сироватки крові хворих на аутоімунні захворювання, протеїназною активністю також володіють мультимерні форми легких ланцюгів імуноглобулінів хворих мієломою (білки Бенс-Джонса) [36] та sIgA молока [4].
1.4.5. ДНК-гідролізуючі АТ (ДНК-абзими). ДНК - гідролізуючі антитіла належать до найбільш вивчених на сьогодні абзимів. Імуноглобуліни класу G, які володіють топоізомеразною активністю (каталізують однониткові розриви надспіралізованої форми плазмідної ДНК), вперше було виділено з плазми крові хворих на системний червоний вовчак. Інтенсивні дослідження наступних років показали, що абзими із аналогічною активністю містяться у сироватці крові хворих на різні аутоімунні захворювання (склеродермія, ревматоїдний артрит, тиреоїдит, розсіяний склероз), а також у хворих на СНІД, променеву хворобу, гепатит та лімфопроліферативні типи онкологічних захворювань. У наступних дослідженнях встановлено, що ДНК-гідролізуючою активністю володіють також sIgA молока людини [4, 8, 16, 23, 24, 42, 54, 62].
1.4.6. Полісахарид-гідролізуючі абзими. Встановлено, що IgG і IgМ плазми крові хворих на ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, пієлонефрит та деякі онкологічні захворювання гідролізують мальтозовмістні олігосахариди, глікоген та подібні їм сполуки. Полісахарид-гідролізуюча активність притаманна IgG та sIgA молока і молозива людини. Особливістю абзимів молока є їхня висока полісахарид-гідролізуюча активність (у 5-50 разів вища порівняно з подібними абзимами сироватки крові хворих на аутоімунні захворюваня), що вказує на їх важливу роль у метаболізмі олігосахаридів молока людини [4, 41].
1.5. Роль процесів сіалування/десіалування у функціонуванні імунної системи
1.5.1. Структура та функції сіалових кислот
1.5.1.1. Структура сіалових кислот
Сіалові кислоти – це кислі моносахариди, карбонові скелети яких містять 9 атомів Карбону. Вони переважно є термінальними частинами гліканових ланцюгів клітинних мембран хребетних, а також входять до складу секреторних глікокон’югатів. Основними типами сіалових кислом у ссавців є N-ацетилнейрамінова кислота (Neu5Ac) та її гідроксильоване похідне – N-гліколілнейрамінова кислота (Neu5Gc). Людські клітин синтезують лише Neu5Ac кислоту через гомозиготну делецію гена Neu5Ac-гідроксилази, що відповідає за синтез її гідроксильованого похідного. [60, 63].
(1)
(2)
Рис. Просторові формули N-гліколілнейрамінової (1) та N-ацетилнейрамінової (2) кислот [60]