2.2.5. Інгібування сіалідазної активності антисіалільних IgG-антитіл інгібіторами клітинних сіалідаз
До 150 мкл зразку, у якому визначали активність, додавали 50 мкл 0,5 мМ 4-метилумбеліферилнейрамінату натрію, інгібітори 15 μM DANA (2-дезокси-2,3-дидегідро-N-ацетилнейрамінова кислота) або 15 μM озельтамівір та інкубували при 37о С протягом 1-2 годин (рис. 3) [55]. Зразок розводили на 0,2 М ацетатному буфері із 5 мМ CaCl2 та 5мМ MgCl2, рН 4,2. Для зупинки реакції до реакційної суміші додавали 1 мл гліцинового буферу (рН 10,7) із 60 мМ NaCl та 166 мМ Na2CO3. Флуориметрію проводили із використанням фільтрів довжин збудження та випромінювання, характерних для 4-метилумбеліферолу.
Рис. 3. Схема будови інгібіторів сіалідаз DANA (1) та озельтамівір (2) [55]
2.2.6. Електрофоретичне розділення білків у пааг.
Електрофорез очищених препаратів білків проводили в блоках 12 % ПААГ у буферній системі Лемлі за присутності ДСН. Зразки і білкові стандарти вносились за допомогою шприца на дно лунок в розрахунку 5 мкг білка на одину доріжку. Для приготування зразків використовували 4х Леммлі буфер:
0,5 M трис-HCl, pH 6,8
20 % гліцерин
20 % ДСН
1 % бромфеноловий синій
8 % β-меркаптоетанол.
Електрофорез вели при силі струму 20 мА на пластину протягом 2 год.
Після електрофорезу гелі забарвлювали для виявлення розділених білків за допомогою фарби, до складу якої входили: 0,2 % Coomassie R-250 або G-250, 20 % метанолу та 10 % оцтової кислоти, протягом 20 хв з наступним відмиванням у 20 % метанолі та 5 % оцтовій кислоті при помішуванні. Використовували стандарти молекулярної маси білків: Unstained Precision Protein Standards („BioRad”), Protein Molecular Weight Markers („Fermentas”).
3. Результати досліджень та їх обговорення
3.1. Виділення та очистка IgG із сироватки крові хворих на счв та визначення їхньої сіалідазної активності
Було обстежено 65 пацієнтів із системним червоним вовчаком, серед них 55 (84,7%) жінок та 10 (15,3%) чоловіків віком від 17 до 65 років, середня тривалість хвороби складала 6 років та два місяці. Діагноз СЧВ виставляли відповідно до рекомендацій АCR (1997). Контрольну групу склало 10 клінічно здорових донорів відповідного віку та статті. Із крові хворих та клінічно здорових донорів шляхом тристадійного висолювання 50% (NH4)2SO4 отримували тотальну фракцію імуноглобулінів, яку перевіряли на сіалідазну (нейрамінідазну) активність флюорометричним методом. Показано, що антитіла хворих на СЧВ проявляють високу сіалідазну активність, натомість імуноглобуліни здорових донорів зовсім неактивні. Виникло питання про те, які саме імуноглобуліни проявляють зазначену активність. Тому наступна стадія дослідження включала афінну хроматографію тотальної фракції імуноглобулінів на колонці, яка містить протеїн G-сефарозу – сорбент, специфічний для виділення IgG. IgG, виділені із сироватки крові хворих на СЧВ, досліджували методом гель-електрофорезу у 12% ПААГ за присутності ДСН. Як видно з рис. 1, одержані фракції IgG є електрофоретично гомогенними, за молекулярною масою відповідають імуноглобулінам класу G та позбавлені домішок чи забруднень. Отже, метод афінної хроматографії на колонці із протеїн G-сефарозою є ефективним для виділення IgG із сироватки крові хворих на СЧВ.
Рис. 1. Отримання високо очищених препаратів IgG-антитіл із сироватки крові хворих на СЧВ методом афінної хроматографії білків на колонці із протеїн G-сефарозою
Далі досліджували сіалідазну активність високо очищених препаратів IgG флюорометричним методом (рис. 2). Субстратом слугував 2’-(4-метилумбеліферил)-α-D-нейрамінат натрію. Час ферментативної реакції становив 3 години. Як видно з рис. 2, усі препарати IgG хворих на СЧВ характеризуються певним рівнем сіалідазної активності. Відмінність у рівні сіалідазної активності IgG може бути пов’язана із ступенем важкості перебігу захворювання.
Рис. 2. Визначення сіалідазної активності препаратів IgG, очищених із сироватки крові хворих на СЧВ