2.2.2. Одержання (Fab)2 антисіалільних IgG-антитіл із сироватки крові хворих на счв
Перед проведенням гідролізу IgG діалізували проти 0,2 М натрій ацетату, pH 4,0. IgG-антитіла піддавали ферментативному гідролізу під дією пепсину, як описано у [1]. F(ab)2 фрагменти очищували за допомогою афінної хроматографії на колонці із сорбентом муцин-сефарозою із наступною афінною хроматографією на колонці з протеїн G-сефарозою. Буфером для елюції в обох випадках слугував 0,1 М гліцин-НСl (рН 2,6). Отримані зразки діалізували проти 20 мМ буферу трис-HCl, pH 7,5, після чого у них вимірювали сіалідазну активність.
2.2.3. Флуориметричне вимірювання сіалідазної (нейрамінідазної) активності IgG і (Fab)2
Нейрамінідазну активність визначали прямим ферментативним методом за нагромадженням флуоресцентного продукту розщеплення специфічного субстрату 2’-(4-метилумбеліферил)-α-D-нейрамінату натрію (рис. 2) [63]. Ця речовина після дії нейрамінідази розщеплюється на нейрамінову кислоту і 4-метилумбеліферил, що має максимум поглинання при 325 нм і максимум випромінювання при 450. До 150 мкл зразку, у якому визначали активність, додавали 50 мкл 0,5 мМ 4-метилумбеліферилнейрамінату натрію (Sigma) і інкубували при 37о С протягом 1-2 годин (для встановлення числового значення активності важливо знати точно час інкубації). Зразок розводили на 0,2 М ацетатному буфері із 5 мМ CaCl2 та 5мМ MgCl2, рН 4,2. Для зупинки реакції до реакційної суміші додавали 1 мл гліцинового буферу (рН 10,7) із 60 мМ NaCl та 166 мМ Na2CO3. Флуориметрію проводили із використанням фільтрів довжин збудження та випромінювання, характерних для 4-метилумбеліферолу. Для нівелювання впливу самочинної деградації субстрату використовували контроль у складі 150 мкл ацетатого буферу, рН 4,2 та 50 мкл 0,5мМ субстрату, інкубованого у тих же умовах, що й дослідні зразки. Пізніше, отримане для контролю значення відносної інтенсивності флуоресценції віднімалось від значення для кожного дослідного зразка. Для переведення відносних одиниць у абсолютне значення концентрації субстрату, що був гідролізований зразком протягом даного часу, використовували стандартні розчини 4-метилумбеліферолу у гліциновому буфері (рН 10,7). За відомими значеннями концентрації гідролізованого субстрату, часу, протягом якого відбувався цей гідроліз та концентрації білка у зразку встановлювалась питома активність, виражена в міжнародних одиницях активності на міліграм білка (U/мг білка).
Рис. 2. Схема гідролізу 2’-(4-метилумбеліферил)-α-D-нейрамінату (4-MUNA) під дією антисіалільних IgG із сироватки крові хворих на СЧВ [63]
2.2.4. Визначення сіалідазної (нейрамінідазної) активності IgG після ренатурації із пааг
IgG, попередньо очищені із сироватки крові хворих на СЧВ та клінічно здорових донорів за наведеною вище схемою, розділяли методом електрофорезу у 12% ПААГ за присутності ДСН. Гель фарбували Coomassie R-250, після чого вирізали бенди, що відповідали IgG. До вирізаних шматочків гелю додавали 0,5 мл лізуючого буферу (20 мМ трис-HCl, pH 7,8, 100 мМ гліцин, 500 мМ NaCl), після чого іх розтирали у ступці [53]. Нерозчинні залишки гелю відбирали після центрифугування при 13000g протягом 5 хв. Далі супернатант відділяли і концентрували. У подальшому з нього виділяли IgG методом афінної хроматографії на колонках із муцин- та протеїн G-сефарозою, після чого визначали сіалідазну активність ренатурованих IgG.