1.5.3.1. Абзими, що володіють сіалідазною активністю

У сироватці крові дітей, хворих на гостру лімфобластну лейкемію, виявлено IgG- та IgM-антитіла, здатні зв’язувати О-ацетильовану сіалову кислоту. Такі антитіла можуть зумовлювати аглютинацію еритроцитів, що містять 9-О-ацетильовану сіалову кислоту на своїй поверхні. Окрім того, вони викликають комплемент-незалежний (10,2-17,4% клітин) та комплемент-залежний (51,0-77,0% клітин) цитоліз лімфобластів [21, 46].

Нещодавно ми встановили, що в сироватці крові хворих на множинну мієлому присутні IgG-антитіла, здатні гідролізувати синтетичні субстрати дії сіалідаз (2'-(4-метилумбелліферил)-α-D-N-ацетилнейрамінову кислоту) та відщеплювати сіалільні залишки глікопротеїнів і гангліозидів плазматичних мембран клітин крові людини [18]. Антитіла із сіалідазною активністю не було виявлено в сироватці крові клінічно здорових донорів, а також у хворих на ревматоїдний артрит. Також ми показали, що десіалування глікоротеїнів плазматичних мембран еукаріотичних клітин стимулює їхній фагоцитоз макрофагами [18]. Отримані дані вказують, що сіаліл-гідролізуючі IgG-антитіла сироватки крові можуть бути залучені у кліренсі апоптичних і некротичних клітин у хворих на деякі автоімунні і гематоонкологічні захворюваннями. На сьогодні походження цих каталітичних антитіл залишається не з’ясованим.

2. Матеріали і методи досліджень

2.1. Реактиви і матеріали

При виконанні роботи використовувались наступні реактиви:

Акриламід Serva

Амоній персульфат Bio-Rad

Амоній сульфат Sigma

Білкові маркери Fermentas

Бромфеноловий синій Invitrogen

Гліцерол Serva

Гліцин Merck

Кальцій хлорид Merck

Магній хлорид Sigma

Натрій азид Flucka

Натрій ацетат Sigma

Натрій додецил сульфат Sigma

Натрій карбонат Merck

Натрій хлорид Sigma

Натрій 4-метилумбеліферилнейрамінат Sigma

Озельтамівір Sigma

Пепсин Sigma

Перекис водню Тернофарм

Твін 20 Sigma

Трис Ultra Pure ICN Biomedicals, Inc

N',N'-метиленбісакриламід Reanal

N,N,N’,N’-Тетраметилетан-1,2-діамін Sigma

β-меркаптоетанол Sigma

Coomassiе Blue R-250 Reanal

Coomassiе Blue G-250 Reanal

Ponceau Red Reanal

У роботі використано сорбент протеїн G-сефарозу (Sigma). Сорбенти муцин-сефароза та трансферин-сефароза виготовлено у відділі регуляції проліферації клітин та апоптозу ІБК НАН України із комерційно доступної активованої сефарози та препаратів муцину і трансферину, відповідно.

Сироватки крові здорових донорів і хворих на аутоімунні захворювання надано у рамках договору про співпрацю д.м.н. Негрич Т. І. (Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького).

2.2. Методи досліджень

2.2.1. Очищення антисіалільних IgG-антитіл із сироватки крові хворих на счв та рс

IgG виділяли за тристадійною схемою (рис. 1). Для цього 1 мл сироватки крові центрифугували при 5000 g протягом 5 хв, АТ осаджували 50% розчином (NH₄)₂SO₄ [1]. Осад діалізували проти 0,15 М NaCl у 20 мМ трис-HCl (pH 7,5) протягом 18 год і очищали методом афінної хроматографії на колонці, наповненій сорбентом муцин-сефарозою. IgG елюювали з колонки 0,1 М гліцин-НСl (рН 2,6) та нейтралізували 1,5 М трис-HCl (pH 8,8), після чого АТ діалізували проти розчину 20 мМ трис-HCl (pH 7,5) протягом 18 год. Далі імуноглобуліни вносили на колонку із сорбентом протеїн G-сефарозою для виділення IgG-антитіл. Процедура виділення та діалізу аналогічна до попередньої. Концентрацію білка у зразках вимірювали на спектрофотометрі NanoDrop ND-1000 (NanoDrop, США).

Рис. 1. Схема очищення антисіалільних IgG-антитіл із сироватки крові хворих на СЧВ