60

Міністерство освіти і науки, молоді та спорту України

Львівський національний університет імені Івана Франка

Біологічний факультет

Кафедра біохімії

Дипломна робота бакалавра

на тему: СІАЛІДАЗНА АКТИВНІСТЬ І АНТИГЕННА СПЕЦИФІЧНІСТЬ АНТИТІЛ СИРОВАТКИ КРОВІ ХВОРИХ НА СИСТЕМНИЙ ЧЕРВОНИЙ ВОВЧАК ТА РОЗСІЯНИЙ СКЛЕРОЗ

Виконала:

студентка IV курсу, групи БЛБ-44

напряму підготовки 6.040102 – біологія

Корній Наталя Сергіївна

Керівники:

зав. кафедри біохімії, проф. Сибірна Н.О

ст.н.с. ІБК НАН України, д.б.н. Кіт Ю.Я.

Рецензент:

зав. кафедри фізіології людини і тварин, проф. Манько В.В.

.

Львів - 2013

ЗМІСТ

ВСТУП 5

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 7

1.1. Аутологічні антитіла, їх продукція та характеристики 7

1.2. Функціональна активність аутоантитіл в нормі та при аутоімунних захворюваннях 8

1.2.1. Ауто-АТ і рецептори клітин 8

1.2.2. Ауто-АТ та іонні канали 9

1.2.3. Ауто-АТ та імунні комплекси 9

1.2.4. Ауто-АТ і система комплементу 9

1.2.5. Ауто-АТ із різнонаправленою патогенною активністю 10

1.3. Аутоімунні захворювання 10

1.3.1. Системний червоний вовчак – системна імунопатія 11

1.3.2. Розсіяний склероз 13

1.4. Антитіла із каталітичною ензимоподібною активністю – абзими 15

1.4.1. Абзими, які володіють протеїнкіназною активністю 17

1.4.2. Абзими, які володіють ліпідкіназною активністю 17

1.4.3. Нуклеотид-гідролізуючі абзими молока людини 18

1.4.4. Протеїн-гідролізуючі АТ (протабзими) 18

1.4.5. ДНК-гідролізуючі АТ (ДНК-абзими) 18

1.4.6. Полісахарид-гідролізуючі абзими 18

1.5. Роль процесів сіалування/десіалування у функціонуванні імунної системи 19

1.5.1. Структура та функції сіалових кислот 19

1.5.1.1. Структура сіалових кислот 19

1.5.1.2. Значення сіалових кислот для функціонування імунної системи 19

1.5.2. Вплив процесів сіалування-десіалування на структуру та функції імуноглобулінів 22

1.5.3. Анти-сіалільні антитіла у нормі та при патології 24

1.5.3.1. Абзими, що володіють сіалідазною активністю 26

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ 27

2.1. Реактиви і матеріали 27

2.2. Методи досліджень 29

2.2.1. Очищення антисіалільних IgG-антитіл із сироватки крові хворих на СЧВ та РС 29

2.2.2. Одержання (Fab)₂ антисіалільних IgG-антитіл із сироватки крові хворих на СЧВ 30

2.2.3. Флуориметричне вимірювання сіалідазної (нейрамінідазної) активності IgG і (Fab)2 30

2.2.4. Визначення сіалідазної активності антисіалільних IgG-антитіл після ренатурації з ПААГ 31

2.2.5. Інгібування сіалідазної активності антисіалільних IgG-антитіл інгібіторами клітинних сіалідаз 32

2.2.6. Електрофоретичне розділення білків у ПААГ 32

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ 34

3.1. Виділення та очистка IgG з сироватки крові хворих на СЧВ та визначення їхньої сіалідазної активності 34

3.2. Виділення та очистка антисіалільних IgG-антитіл із сироватки крові хворих на СЧВ 36

3.3. Дослідження сіалідазної активності та субстратної специфічності антисіалільних IgG-антитіл 38

3.4. Інгібування сіалідазної активності антисіалільних IgG-антитіл 39

3.5. Визначення сіалідазної активності антисіалільних IgG-антитіл, ренатурованих з ПААГ 40

3.6. Одержання (Fab)₂ антисіалільних IgG-антитіл 42

3.7. Визначення сіалідазної активності (Fab)₂ антисіалільних IgG-антитіл 43

3.8. Дослідження сіалідазної активності антитіл сироватки крові хворих на розсіяний склероз 43

4. ОХОРОНА ПРАЦІ 45

Вступ 45

4.1. Аналіз стану умов праці 45

4.1.1. Характеристика лабораторії 45

4.1.2.Аналіз методів дослідження та характеристика обладнання 46

4.1.3. Характеристика об'єкту дослідження, речовин, їхніх небезпечних властивостей 47

4.2. Організаційно–технічні заходи 48

4.2.1.Організація робочого місця і роботи 48

4.2.2. Санітарно–гігієнічні вимоги до умов праці 49

4.2.3. Заходи щодо безпеки під час роботи з обладнанням, об'єктом дослідження і речовинами 49

4.3. Безпека у надзвичайних ситуаціях 51

4.3.1. Протипожежні та проти вибухові заходи 51

4.3.2. Організація евакуації працівників 51

ВИСНОВКИ 53

ЛІТЕРАТУРА 54

ВСТУП

Імунна система ссавців забезпечує не лише захист організму від шкідливих чинників навколишнього середовища, але й бере участь у регуляції багатьох біологічно важливих процесів, необхідних для підтримання гомеостазу. Гуморальна ланка імунного захисту функціонує через продукцію мільйонів білкових молекул – антитіл (АТ), які переважно спрямовані проти чужорідних антигенів, однак, можуть реагувати і з антигенами власного організму (аутологічними антигенами) [29]. Аутологічні антитіла через безпосередню або опосередковану взаємодію із аутоантигенами можуть зумовлювати розвиток аутоімунних захворювань. Ауто-АТ із спорідненістю до різноманітних біомакромолекул (білків, нуклеїнових кислот, полісахаридів, ліпідів) виявлено як у хворих на аутоімунні захворювання, так і в клінічно здорових людей, однак, в останніх – у слідовій концентрації [41]. Таким чином, ці АТ можуть слугувати молекулярними маркерами, придатними як для діагностики аутоімунних хворіб, так і для прогнозування особливостей їхнього перебігу у пацієнтів.

Системний червоний вовчак (СЧВ) – системне аутоімунне захворювання, яке характеризується дисфункцією Т-, В- лімфоцитів і дендритних клітин, продукцією антинуклеарних антитіл та має ряд клінічних проявів, в основі яких лежать ураження строми та дрібних судин життєво-важливих органів (нирок, легень, серця, головного мозку) [15, 17]. Упродовж останніх 30 років спостерігається деяке покращення прогнозу щодо цієї хвороби, однак смертність та інвалідність пацієнтів із СЧВ залишаються на досить високому рівні. У 2011 р. серед дорослих зареєстровано 6471 (14,5 на 100 тис. населення) хворого на СЧВ, працездатних — 4420 (16,1), що становить 68,3% усіх [17]. Новітні дослідження виявили, що такі негативні фактори як дебют СЧВ у дитинстві або у віці, старшому, ніж 50 років, призначення активної терапії через значний час після первинного прояву хвороби призводять до розвитку у пацієнтів важких клінічних ознак, а саме: ураження нирок, серцево-судинної, дихальної та центральної нервової системи [15].

Відомо, що процеси сіалування/десіалування глікопротеїнів і гліколіпідів поверхні клітинних мембран тісно пов'язані з канцерогенезом, інвазивністю, метастатичним потенціалом, а також із кліренсом постарілих клітин [38]. Окрім того, встановлено, що вміст сіалільних залишків у вуглеводних детермінантах молекул IgG визначає їхні анти- або прозапальні властивості в організмі людини [5, 13, 31]. Відомо, що у десіалуванні глікопротеїнів і гліколіпідів залучені чотири типи сіалідаз, які локалізовані у різних компартментах еукаріотичних клітин [38]. Натомість вміст сіалідаз у позаклітинних рідинах, і, зокрема, в сироватці крові, залишається маловивченим як у нормі, так і при патології.

Нещодавно ми встановили, що в сироватці крові хворих на множинну мієлому та системний червоний вовчак присутні IgG-антитіла, здатні гідролізувати синтетичні субстрати дії сіалідаз та відщеплювати сіалільні залишки глікопротеїнів і гангліозидів плазматичних мембран клітин крові людини [18]. Натомість такі антитіла не виявлені в сироватці крові клінічно здорових донорів, а також у хворих на ревматоїдний артрит і розсіяний склероз. На сьогодні походження цих каталітичних антитіл залишається не з’ясованим.

Метою даної роботи було дослідити сіалідазну активність та субстратну специфічність IgG-антитіл сироватки крові хворих на системний червоний вовчак та розсіяний склероз.

Основні завдання:

1. Розробити схему очистки антисіалільних IgG-антитіл із сироватки крові хворих на СЧВ та розсіяний склероз.

2. Дослідити сіалідазну активність отриманих фракцій імуноглобулінів.