18. Современныеметодыобследованиябольноготуберкулезом. Диагностическийминимумобследованиябольноготуберкулезом.(одм)

ОДМ (обязательныйдиагностическийминимумприобследованиилицспатологиейоргановдыхания):

1 .Целенаправленнособранныйанамнез.

2. Стетоакустическоеисследованиеоргановдыхания.

3.Рентгенологическое исследованиеоргановдыхания (крупнокадроваяфлюорография, обзорнаярентгенографияоргановгруднойклетки, компьютернаярентгенограмма).

4.Общийанализкрови. 5.Общийанализмочи.

6.Исследование мокроты (промывныхводбронхов) наМБТ (3-хкратнаябактериоскопия).

7.Проба Мантус 2ТЕППД- Л

19. Инструментальныеметодыобследованияиихрольвдиагностикеидифференциальнойдиагностикетуберкулеза. Инструментальныеметодыдиагностическиеоперативныевмешательства (инвазивные):

1. Диагностическаябронхоскопия.

2. Трансторакальнаяаспирационнаябиопсиялегкого.

3. Пункцияпериферическоголимфатическогоузла.

4. Плевральнаяпункция.

5. Бронхография.

6. Плевроскопия.

7. Видеоторакоскопиясбиопсией.

8. Биопсияпрескаленойклетчатки.

9. Медиастинотомия.

10. Открытаябиопсиялегкого.

20. ЛабораторныеметодывыявлениямикобактерийтуберкулезаМетодыобследованиянаМбт

МЕТОДЫБАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙДИАГНОСТИКИТУБЕРКУЛЕЗАБактериологическаялабораторияиграетсущественнуюрольввыявлении, диагностикетуберкулеза, выборерациональныхсхемхимиотерапиииоценкеихэффективности. Бактериологическаядиагностикавключаетобработкуклиническогоматериала, микроскопическоеисследование, выделениемикроорганизмасприменениемкультуральныхметодов, идентификациюмикобактерийсиспользованиембактериологическихибиохимическихгестов, атакжеопределениелекарственнойчувствительностимикобактерий.

Существуетнесколькогруппметодов, используемыхдлявыявленияМБТвразличномдиагностическомматериале: рутинные (микроскопия, культуральноеисследование), биологические (биопроба, определениевирулентностиштаммовМБТ). автоматическиесистемы(MGIT, ВАСТЕС, МВ/ВасТ, ESPCultureSystemидр.), молекулярнойгенетическиеметодики(PCR. I.CR, NASBA, Q-Belaидр.). Каждыйизэтихметодовобладаетопределеннойчувствительностьюиспецифичностью, чтонеобходимоучитыватьприклиническойинтер­претацииполученныхрезультатов.

Бактериоскопическоеисследование.

БактериоскопическоеисследованиемокротысокраскоймазкапоЦилю-Нильсенудлявыявлениякислото­устойчивыхмикобактерий (КУБ) являетсянаиболеебыстрым, доступнымиэкономическиэффективнымизсуществующихметодоввыявлениябольныхтуберкулезом. Ономожетбытьосуществленовлюбойклинико- диагностическойлаборатории (КДЛ) лечебно-профилактическихучрежденийвсехуровнейиведомств. Бактериоскопиямокротыпредставляетсячрезвычайноинформативнойдлявыясненияэпидемиологическойопасностипациентадляокружающих, котораякоррелируетсчисломмикобактерийвобразце. Бактериоскопическоеисследование, проведенноедолжнымобразом, имеетположительнуюпрогностическуюценностьдлялегочноготуберкулеза, более 90%. Разрешающаяспособностьданногометодасоставляет 50-100 тыс. микобактерийв 1 миллилитремокротыисущественнозависитотрядафакторов: правильностисборамокроты, подготовленностилабораторногоперсоналаиразрешающейспособностииспользуемыхмикроскопов. Примикроскопиимазков, приготовленныхизпроб, взятыхвтечениетрехпоследовательныхдней, результативностьметодаповышаетсяна 20-30%. Однаконетнеобходимостииспользоватьболее 4-5 пробмокроты.

МетодокраскипоЦилю-Нильсенунаиболеечастоиспользуетсяприбакгериоскопичсскомвыявлениимикобактерий. Онзаключаетсявследующем: мазкимокротыокрашиваютфуксиномпринагревании, затемобесцвечиваютсолянокислымспиртомидокрашиваютметиленовымсиним. Врезультатемикобактерийокрашиваютсявмалиновыйцвет, афон — всиний. Этоспецифическоеокрашиваниеобусловленоспособностьюмикобактерийудерживатькрасительприобработкекислотойилиспиртом.

Вбактериологическихлабораториях, выполняющихбольшоеколичествоисследований (100 иболееежедневно), используетсялюминесцентнаямикроскопия. Данныйметодоснованнаспособностилипидовмикобактрийвосприниматьлюминесцентныекрасители (акридиновыйоранжевый, аурамин, родаминидр.) изатемсветитьсяприоблученииихультрафиолетовымилучами. Взависимостиоткрасителей, микобактерийтуберкулезадаютчеткоеярко-красноесвечениеназеленомфонеилизолотисто-желтое - натемно-зеленомфоне. Методлюминесцентноймикроскопииобладаетбольшейчувствительностью, чемсветоваямикроскопия, особенновсочетаниисметодомобогащениядиагностическогоматериала (микроскопияосадка), посколькулюминесцентнаямикроскопияпозволяетобнаружитьизмененныемикобактерий, утратившиекислотоуетойчивость. всвязисчемониневыявляютсяприбактериоскопиипоЦилю-Нильсену. Мазкидлялюминесцентноймикроскопииготовятизосадка, полученногопослеобработкидиагностическогоматериападетергентомспоследующимотмываниемлибонейтрализацией. Приположительномрезультатебактериоскопиимазков, окрашенныхфлуорохромами, должнабытьпроведенаподтверждающаямикроскопиямазков, окрашенныхпоЦилю-Нильсену

Бактериоскопическоеисследованиенеобходимопроводитьоченьтщательно. Обычнообразецисследуютвтечение 15 минут (чтосоответствуетпросмотру 300 полейзрения), чтобысделатьзаключениеоботсутствииилиналичииКУБвпрепарате. Приокрашиваниифлюорохромамидляисследованияодногомазкатребуетсяменьшевремени.

ОсновнымдиагностическимматериаломдлябактериоскопиинаКУБслужитмокрота. РезультатыбактериоскопическогоисследованиянаКУБдругихбиологическихматериалов (различныхжидкостей, тканей, гноя, мочиит.д.) имеютограниченноезначениедлядиагностикитуберкулеза. Так. исследование

мазковизосадкацентрифугированноймочиневсегдапозволяетполучитьдостоверныерезультаты, посколькувмочемогутприсутствоватьнетуберкулезныемикобактерий. ПоэтомувыявлениеКУБвмоченевсегдасвидетельствуетоналичииспецифическогопроцесса. Вмазкахизосадкапромывныхводжелудкаидругихматериаловмогутобнаруживатьсякислотоустойчивыеса-профиты, которыелегкоспутатьсМВТ.

Результатмикроскопическогоисследованияпозволяетсделатьзаключениетолькооналичииилиотсутствиивпрепаратекислотоустойчивыхбактерий. Достовернодиагноз«туберкулез»можноустановитьтолькопослевыделенияизклиническогоматериалакультурыМБТспомощьюкультуральногометодаиееидентификации. Отрицательныйрезультатбактериоскоскопическогоисследованиянеисключаетдиагноз«туберкулез», таккаквмокротенекоторыхпациентовможетсодержатьсяменьшемикобактерий, чемпозволяетвыявитьбактериоскопия.

КоличествообнаруженныхКУБопределяетстепеньтяжестизаболеванияиопасностибольногодляокружающих. Следовательно, исследованиедолжнобытьнетолькокачественным, ноиколичественным. ВсовременныхэпидемиологическихиэкономическихусловияхбактериоскопическоеисследованиемокротыуобратившихсявЛПУзаврачебнойпомощьюлицсклиническимисимптомами, подозрительныминатуберкулез, являетсяприоритетнымнаправлениемвтактикераннеговыявленияданногозаболевания. Возрастаниеролиэтогометодасвязанотакжесвозникновениемвпоследниегодыостропрогрессирующихформзаболевания, сопровождающихсявыраженнымиклиническимипроявлениямииобильным

Культуральное (бактериологическое) исследование. НачинаясовременипроведенияработКохаидо 1924 г. усилияученых, направленныенапоискиметодоввыделениячистыхкультурмикобактерийтуберкулеза, неимелиособыхуспехов. В 1924 г. ЛевенштейниСумиошиустановили, чтокислотыищелочивизвестныхконцентрацияхиприопределенныхэкспозицияхубиваютсопутствующуюмикрофлору, невлияянажизнеспособностьМБТ. Этотметодпринепрерывномсовершенствованиисталприобретатьпрактическоезначение. Внастоящеевремябактериологическое (культуральное) исследованиебиологическогоматериаланаМБТблагодаряеговысокойчувствительности (от 10 до 100 жизнеспособныхмикробныхклетокв 1 млисследуемогоматериала) испецифичностивсочетаниисмикроскопическимметодомявляется«золотымстандартом»вдиагностикетуберкулеза. Бактериологическоеисследованиенатуберкулезвыполняетсявспециализированныхбактериологическихлабораторияхпротивотуберкулезныхдиспансеровилипосевныхпунктах.

Материалдлябактериологическогоисследованиясобираютасептически. Передпроведениембактериологическогоисследованияпоступившиевлабораториюпробыобрабатываютрастворамикислотилищелочейспоследующимцентрифугированием. Этонеобходимодняразжиженияиконцентрацииобразца, атакжедляпредотвращенияконтаминации, посколькупробымокротывязкиепоконсистенцииисодержатбольшоеколичествомикрофлоры. Около 1 млразжиженногоидеконтаминированногоклиническогообразцазасеваютвпробиркисосредойиинкубируютпри 37°Свтечение 10 недель.

Длякультивированиямикобактерийиспользуютплотные (яичные, агаровые) ижидкиепитательныесреды. Яичныесредысодержа! цельныеяйцаилияичныйжелток, атакжефосфолипидьг, белкиидругиеингредиенты. Сцельюпредотвращенияконтаминацииксредедобавляютнекоторыекрасители, например, малахитовыйзеленый, атакжеантибиотики. Поэтомуяичныесреды (Левеншейна-Йенсена, Финна), накоторыхкультивируютмикобактерий. имеютсине-зеленыйцвет. ИспользованиеяичныхсредпозволяетполучитьвидимыйростколонийМtuberculosisчерез 18-24 дняввидесухогоморщинистогоналетакремовогоцвета. Однакокачествоингредиентов, изкоторыхготовитсясреда, иногдазначительноварьирует, чтоможетвлиятьнавоспроизводимостьрезультатов. Посравнениюсяичнымиагаровыесредыимеютрядпреимуществ: ониготовятсяизполусинтетическихоснов, чтообеспечиваетболеестабильноекачествоивоспроизводимостьрезультатов. ДетекцияростаМБТнаагаровыхсредахвозможначерез 10-14 дней. Однакоагаровыесредыдороже, требуютприсутствияСО2 ватмосфереиинкубируютсявтермостатенеболее 1 месяца.. Какправилодлявыделениямикобактерийиспользуетсянабориздвухразныхпитательныхсред.

Автоматическиесистемы. РазработкарадиометрическойсистемыВАСТЕС 460 (BectonDickinson) ознаменованасобойкачественныйпрорыввбыстройдетекциимикобактерийиопределенииихлекарственнойчувствительности

Автоматическиесистемы, предназначенныедлявыявлениямикобактерийтуберкулеза, позволяютпроводитьдетекциюростамикобактерийв 2-3 разабыстрее, чемклассическиеметоды. Положительныйрезультатанализадолженобязательноподтверждатьсябактериоскопически. Впрактикебактериологическихлабораторийисследованиесиспользованиемавтоматическихсистемобязательнопроводитсяпараллельносисследованиемнаплотныхпитательныхсредах

Идентификациимикобактерий. Несмотрянато, чтоморфологияколоний, наличиепигментаиростовыехарактеристикидаютнекоторое

представлениеовыделенномштаммемикобактерий, дляустановленияихвидовойпринадлежностимикобактерийиспользуюткомплексспециальныхлабораторныхтестов. В 1970-хгг. Международнойрабочейгруппойпотаксономиимикобактерийбыластандартизованасериявысоковоспроизводимыхбиохимическихгестов, которыенетребуютсложноготехническогообеспеченияимогутбытьпроведенызанесколькочасовилидней. Этоспособностьштаммамикобактерийсинтезироватьникотиновуюкислоту, восстанавливатьнитраты, продуцироватьуреазу, проявлятьразличнуюрезистентностькантибиотикам, атакжекаталазнаяактивностьитермостабильностькаталазыштаммаМБТ. Кромеэтого, дляидентификациимикобактерийиспользуетсянаборбактериологическихтестов: скоростьростанапитательныхсредах, способностьмикобактерийобразовыватькорд-фактор, пигмент, растинаяичнойилипростойагаровойсредеприразныхтемпературныхрежимах; насредах, содержащихNaCl, пара-нитробензойнуюкислотуилисалициловокислыйнатрий.

Методыопределениялекарственнойчувствительностимикобактерий.

Влабораторнойпрактикеиспользуюттриосновныхметодаопределениялекарственнойчувствительностимикобактерий: методабсолютныхконцентраций; методсоотношениярезистентности; методпропорций.

Методабсолютных (предельных) концентрациизаключаетсявследующем. Микобактерийвыращиваютнапитательныхсредах, содержащихпротивотуберкулезныепрепараты (ПТП) вразличныхконцентрациях. ОпределениелекарственнойчувствительностиМБТможетбытьпрямым (посевнасредыспротивотуберкулезнымипрепаратамипатологическогоматериала) инепрямым (посевнасредыспротивотуберкулезнымипрепаратамивыделенныхкультурмикобактерий). Прямойспособпозволяетзначительноускоритьпроцессполучениярезультата, ноимможнопользоватьсятолькотогда, когдамикобактерийобнаруживаютсявисследуемомматериалебакгериоскопическиисодержатсявнемвзначительномколичестве. Лекарственнуючувствительностьможноопределятьнаплотныхижидкихпитательныхсредах. ВсовременнойлабораторнойпрактикеееобычноопределяютнасредеЛевенштейна- Йенсена. несодержащейкрахмала, котораяпринятаВОЗвкачествемеждународногостандарта. УнификацияопределениялекарственнойчувствительностиМБТпозволяетполучатьсравнимыерезультатыприпроведенииэпидемиологическихисследований. Приопределениилекарственнойчувствительностинаплотныхпитатель­ныхсредахрезультатучитываютчерез 3 неделипослепосевапомакроростуМБ'Гнаповерхностисреды, нажидкихпитательныхсредах — через 10-12 днейпоналичиюмикроколонийввидепереплетающихсяжгутовикосвмазкахизосадка.

Определениелекарственнойчувствительностинаплотныхижидкихпитательныхсредахимеетсвоипреимуществаинедостатки. Наплотныхсредахможнополучитьболеечеткосравнимыерезультаты. Примассовыхисследованияхэтотметодменеетрудоемок, однакоонболеепродолжителенповремениполучениярезультата. Вплотныхсредахвовремясвертыванияможетнесколькоуменьшатьсясодержаниенекоторыхтермолабильныхпрепаратов, например, стрептомицина. Определениелекарственнойчувствительностинажидкихсредахболеетрудоемко, требуетмикроскопиипрепаратов, норезультатможетбытьполученвболеекороткиесроки. Недостаткомэтогоспособаявляетсято, чтобольные, леченныеантибактериальнымипрепаратами, могутвыделятьмикобактерий, лишенныекорд-фактора, недающиеприразмножениижгутовилинаукообразныхмикроколоний, наличиекоторыхслужиткритериемустойчивостикпрепарату.

Методсоотношениярезистентности(resistanceratiomethod) заключаетсявопределениисоотношенияминимальныхипгибирующихконцентрацийпротивотуберкулезныхпрепаратовдлятестируемогоштаммаиреференс-штаммаH37RV. чувствительногоковсемпрепаратам. Величинасоотношения 2 именеехарактеризуетшгаммкакчувствительный. 8 иболее — какустойчивый.

ВариантомметодаминимальныхипгибирующихконцентрацийявляетсяE-tcst. Лекарственнаяустойчивостьмикобактерийсиспользованиемэтогометодаопределяетсяначашкахсагаровойсредой, накоторыепомещаютполоски, содержащиеградиентконцентрацийпротивотуберкулезныхпрепаратов. Чувст­вительностьмикобактерийкпрепаратамоцениваетсяпоналичиюзоныингибированияростамикобактерийвокругполоски. ИспользованиеE-teslпозволяетопределятьлекарственнуючувствительностьМБ'Гвтечение 5-10 дней.

МетодпропорциибылпредложенCanettiв 1963 году. Онзаключаетсявопределениисоотношениячислаколоний, выросшихнасреде, содержащейпротивотуберкулезныйпрепарат, ичислаколонийвконтрольнойпробирке, несодержащейпрепарата. Этосоотношениеявляетсяотражениемпропорциирезистентныхбактерийвпопуляции. МетодпозволяетколичественнооценитьстепеньрезистентностиштаммаМБТ, однакоширокоеприменениееговклассическомвариантезатрудненовследствиебольшойтрудоемкости. ОпределениелекарственнойчувствительностимикобактерийметодомпропорцийможетпроводитьсясиспользованиемавтоматическихсистемВАСТЕС, МОIT, EspCultureSystemидр

ЦельюинтерпретациирезультатовопределениялекарственнойчувствительностиМБТкПТПявляютсяпрогнозированиеклиническойэффективностиПТПуконкретногобольногоиобоснованиерекомендацийпо

ОУи. д

проведениюоптимальнойхимиотерапии.

ВкачествекритериевдляотнесенияштаммовМБТккатегориичувствительныхилиустойчивыхиспользуютпороговыезначенияминимальныхингибирующихконцентраций (МИК) ПТП, избранныенаосновекомплексамикробиологических, фармакокинетическихиклиническихпоказателей. ДанныеовеличинеМИКГ1ТГ1 вотношенииштаммовМБТ, выделенныхотбольных, служатмикробиологическимкритериемдляопределениявеличиныпороговыхконцентраций. Крометого, приопределениипороговыхМИКучитываютданныепофармакокинетикеПТП. ОсновнымпоказателемприэтомявляетсямаксимальнаяконцентрацияГ1ТП, котораясоздаетсявсывороткекровипослеприемаПТПвсреднетераггевтическойдозе. ЧеткаязависимостьмеждуэтимпоказателемивеличинамипороговыхМИКотсутствует. Всамомобщемведеможнолишьсказать, чтопороговыеМИКнемогутбытьвышемаксимальнодостижимыхвсывороткекрови. И, наконец, третьимкритериемдляопределенияпороговыхзначенийМИКслужатданныеоклиническойэффективностиПТГ1 призаболевании, вызываемоммикроорганизмамисразличнымиМИК. Такимобразом, предложенныевразныхстранахпороговыезначенияМИКПТПявляютсяплодомконсенсусамеждуведущимиэкспертами, анерезультатомточныхрасчетов. Померенакопленияопытаихпериодическипересматривают. НесмотрянаопределеннуюусловностьрекомендованныхпороговыхзначенийМИКПТП, ониявляютсяединственнойосновойдляпервогоэтапаинтерпретациирезультатовоценкичувствительностиМБТкГ1ТП.

Биологическиеметодыдиагностикитуберкулеза

Биологическаяпроба (биопроба).

Биопробаявляетсяещеоднимметодомвыявлениямикобактерий. Дляэтогочувствительныхктуберкулезуживотных (чащевсегоморскихсвинок) заражаютпатологическимматериалом, взятымотбольного, ивтечение 3 месяцевнаблюдаютзаихвесом, поведением, местнымиизменениями. Есливтечениеэтогосрокаживотноенепогибнет, егозабивают. Морскихсвинок, забитыхилипогибших, обязательновскрываютиоцениваюттуберкулезныеизменения, произошедшиевихорганахживотныхприразвитииспецифическогопроцесса. Дажеприотсутствииспецифическихизмененийдляподтверждениядиагнозаизлимфатическихузлов, легких, печени, селезенкиготовятмазки, которыеокрашиваютпоЦилю-Нильсену. Крометого, кусочкиуказанныхоргановгомогенизируютивысеваютнапитательныесреды. Всомнительныхслучаяхвыполняютгистологическоеисследованиетканей. Чувствительностьбиологическогометодавыявлениямикобактерийвысока (несколькоклетокМБТнапробу). Однаковпоследнеевремяпоявилисьсообщенияотом, чторезультатбиологическогоисследованияневсегдакоррелируетсданнымиклинико- рентгенологическогообследования.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕМЕТОДЫПолимеразнаяцепнаяреакция.

Получениеболеесовершенныхпитательныхсред, разработкаавтоматическихсистемпозволяютсокращатьсрокивыявленияиидентификациимикобактерий. Однакоонивсеещеостаютсядостаточнодлительнымиизависятотколичествавозбудителявинфекционномматериале. Современныемолекулярно- генетическиеметодыоткрываютвэтойобластизначительныеперспективы, таккакпозволяютсвысокойчувствительностьюиспецифичностьюпроводитьвыявлениеитипированиемикобактерийвразличномдиагностическомматериале.

Наиболеечастонапрактикеиспользуетсямолекулярно-генетическийметод, восновекотороголежитпринципполимеразнойцепнойреакции (ПЦР).

ПЦР — принципиальнооченьпростойметодамплификации, т. е. умножениянуклеиновыхкислот. Онбылоткрытвсередине 1980-хгг. КагуMullisссоавторами (биотехнологическаякомпания«Cetus», США).

МетодПЦРоснованнаповторениитрехэтапов, проходящихприразныхтемпературныхрежимах. НапервомэгапедвухцепочечнуюДНКденатурируютпутемкратковременногонагреваинкубационнойсистемыдо 90-95^сС. Такимобразом, двецепочкиДНКостаютсяврастворевнесвязанномдругсдругомсостояниидотехпор. покатемпературанебудетпонижена. Наследующемэтапе, получившемназваниеэтапаотжигапраймеров, которыйпроходитпри 40-60°С, сучасткамиодноцепочечныхмолекулДНК, фланкирующимипоследовательность-мишень, связываютсяпраймеры. ЭтокороткиеучасткиРНКдлинойоколо 20 нуклеотидов. КаждаяиззатравоксвязываетсятолькосоднойцепочкойДНК. СледующийшагПЦРумножениепоследовательности-мишениспомощьюполимеразы. Посколькуинкубационнаясистеманаэтапеденатурацииншреваегсядо 90-95°С, вПЦРиспользуетсятермостабильнаяTaq-полимераза, выделеннаяизThermusaquaticus. Этапдостройкизатравокпроходитпри 70-75°С. Наэтомзаканчиваетсяпервыйцикламплификации. Далеевсеэтапыповторяются 20-25 раз. ВрезультатеколичествоДНК-мишенивозрастаетвгеометрическойпрофессии.

Напрактикеизпатологическогоматериала, взятогоотбольных, припомощиспециальныхметодоввыделяютДНК. Кнейдобавляютреакционныйбуфер, смесьнуклеозидтрифосфатов, праймеры, полимеразуипроводятамплификациювпрограммируемомтермостате (термоциклере). РезультатучитываютспомощьюэлектрофорезавагарозиомгелеилиспомощьюиммобилизованныхфрагментовДНК. Присутствиевпробепоследовательности-мишенисвидетельствуетоналичииМБТвисследуемомобразце. ПЦРпозволяетвыявлять 1-10 бактериальныхклетокв 1 млбиологическогоматериала. Специфичностьреакции — 97-98%.

ИсследованиюметодомПЦРподлежатмокрота, бронхиальныйсекрет, плевральнаяидругиежидкости, моча, периферическаяименструальнаякровь, соскобыэпителиальныхклетокцервикальногоканала.

Следуеготметить, чтоспомощьюПЦРнельзяопределитьактивностьтуберкулезногопроцесса, поэтомуинтерпретироватьполученныйрезультатнеобходимосучетомклинико-рентгенологическихданных. МетодПЦРможноиспользоватькакдополнительныйдиагностическийметодпридифференциальнойдиагностикевкомплексесдругимиметодамилабораторнойдиагностикитуберкулезаинельзяиспользоватьвкачествескрининговогометодадлявыявлениябольныхтуберкулезомиз-завозможностиложноположительныхрезуль- iuiob. Кромею10.препятствиемдляширокогоиспользованияданногометодаслужитнеобходимостьиспользованиядорогостоящегооборудованияидиагностическихнаборов.

ПЦР — неединственныйамплификационныйметоддетекциимикобактерий. Применениеамплификационныхметодикдлявыявленияразличийвгенетическойструктуречувствительныхиустойчивыхштаммов —• ещеодинновыйподходкопределениюлекарственнойчувствительностимикобактерий. Проводитьданныеисследованиясталовозможнымблагодаряопределениюнуклеотидныхпоследовательностейгенов, мутациивкоторыхприводятквозникновениюрезистентностикпротивотуберкулезнымпрепаратам. Прииспользованииамплификационныхметодовзначительносокращаютсясрокиисследования. Главнымограничениемдляихпримененияслужитсуществованиедругихмеханизмоврезистентности. Спомощьюамплификационныхметодикнеобнаруживаетсяоколо 10% случаевустойчивостикрифампицину, 20% — кизониазидуи 40% — кстрептомицину. Поэтомумолекулярныеметоды, никогданесмогутполностьюзаменитьклассическиекультуральныеметодыопределениялекарственнойустойчивостиМБТ.

Генотипирование.

ИсследованияпоэпидемиологиитуберкулезавтечениедлительноговременитормозилисьотсутствиемточногоивоспроизводимогометодасубтитрованияклиническихизолятовдляизученияраспространенияштаммовМБ'Г. Совершенствованиемолекулярно-генетическихметодовпозволилоразработатьвысокоспецифичныемаркерыдлятипированияштаммовМБТ.

ШтаммыМБГневозможноразличитьспомощьюрутинныхбиохимическихтестовилисерологическихметодов. УстойчивостькПТПвнекоторыхслучаяхявляетсявоспроизводимыммаркером, ноэтотмаркернеявляетсяобщепринятым. ДонедавнеговремениединственнымпригоднымметодомдлятипированияштаммовМВТслужилметодфагоптирования. Однакоонтехническисложенииспользовалсявнемногихлабораториях, посколькунепозволяетдобитьсянеобходимойспецифичности, исегопомощьюможновыделитьлишьограниченноечислофаготипов.

Генотипированиепозволяетиспользоватьвкачествемаркеровтонкиеразличиявхромосомемикобактерий, невызывающиефенотипическихразличий. Посколькуполучаемаяврезультатеисследованиякартинаиндивидуачьнадляконкретногоштамма (какотпечаткипатьцевдлячеловека), данныйметодполучилназваниегеномнойдактилоскопии(DNAfingerprint).

ДлятипированиячащевсегоиспользуютспецифичнуюдляМtuberculosisповторяющуюсямобильнуюпоследовательностьДНК, котораядемонстрируетнеобходимыйуровеньполиморфизма. ЧислокопийэтойпоследовательностивысокоубольшинстваизолятовМ. tuberculosis(7-20), низкоубольшинстваизолятовМ. bovisотживотных (1-4) иуразличныхштаммовА/, hovisBCG(1-2).

Методгенотипированияоснованнаиспользованиирсстрикционныхэндонуклеаз. которыераспознаютспецифическиепоследовательностиинарезаютДНКнафрагментыразнойдлины. СодержаниегуанинаицитозинавмикобактериальнойДНКвысоко (около 65%), поэтомуцелесообразнымпризнаноиспользованиеэнзимов, распознающихфрагменты, богатыеадениномитимином, иразрезающихД11Кнанебольшоечислокрупныхфрагментов.

Стандартныйметодпредусматриваетследующиеэтапы: выделениемикобактериальнойДНК. еерестрикциюсиспользованиемэндонуклеаз, разделениерестрикционныхфрагментовпутемэлектрофорезаидетекциюпоследовательности-мишенипосредствомгибридизациисмеченойДНК. Полученнаяврезультатесовокупностьэлектрофорегическихполос (фингерпринт) отражаетчислокопийданнойпоследовательностиДНК (каждаяполосасоответствуетоднойкопиипоследовательности-мишени), атакжегетерогенностьвдлинерестрикционныхфрагментов, котораяобычноявляетсярезультатомточковыхмутаций, создающихилиуничтожающихсайтырестрикции, либоделецийилидругиххромосомныхперестроек, чтонашлоотражениевтермине«полиморфизмдлинырестрикционныхфрагментов»{RestrictionFragmentLengthPolymorphism. RFLP).

Использованиеметодавстандартномвариантеосложняетсянеобходимостьюэкстракциипочти 1 мкг

OHi. «3

ДНКизкаждоюизолята. Поэтомувнастоящеевремяразработаныдвавариантаметодагеномнойдактилоскопии, основанныенаиспользованииПЦР. ОнипозволяютиспользоватьоченьмаленькоеколичествоДНКиполучатькартину, сопоставимуюпоспецифичностисостандартнымметодом. Втакихвариантахисследованиеможетбытьвыполненонабактерияхизнесколькихколонийилистарыхнежизнеспособныхкультурах, атакжеклиническихбактериоскопическиположительныхобразцах.

ВыделенныепривспышкезаболеванияизолятыМБТсбольшойдолейвероятностидемонстрируютодинаковуюгенотипическуюкартину. Поэтомуизоляты, связанныесконкретнойвспышкойзаболевания, можнолегкоидентифицировать. Однакопоканепроведеномасштабноеисследованиесцельюопределенияпредполагаемогочиславозможныхгеногипическихвариантоввконкретномгеографическомрегионе.

ПервымприменениемгенотипированияизолятовМБТбылоотслеживаниевспышектуберкулеза. Так, сиспользованиемэтогометодабылаустановленапричинавспышкитуберкулеза, вызваннойинъекциямиконтаминированныхлекарственныхпрепаратов. Этаработапродемонстрировалаполезностьгеномнойдактилоскопиидляпроведенияэпидемиологическихисследованийипоказала, чтосиспользованиемданногометодаможноидентифицироватьизоляты, связанныесовспышкой, средибольшогоколичестваизолятов. Доказанаполезностьгеномнойдактилоскопиивотслеживаниираспространенияполирезистентныхштаммов. ВрезультатенесколькихисследованийбылоописанонозокомиальноераспространениетакихштаммовсредиВИЧ-инфицированныхбольных. Вкаждомизтакихисследованийбылиидентифицированы 1 или 2 штамма, связанныесовспышкойзаболевания. ИспользуемаядлятипированияпоследовательностьДНКнекодируетлекарственнуючувствительность, поэтомурезистентностькПТПневлияетнакартинуфингерпринта. Однаковданномслучаефингерпринтможетслужитьмаркеромданногоштаммаиуказыватьналекарственнуюрезистентностьновыхизолятовстакимжефингерпринтом.

Приэпидемиологическихисследованияхвспышекполирезистентноготуберкулезалекарственнаяустойчивостьуказываетнавозможностьэпидемиологическойсвязимеждуштаммами, геномнаядактилоскопияобеспечиваетокончательноедоказательство. Методдажеболееполезендляпроведенияисследованияполирезистентныхизолятов, посколькуэтоединственныйметоддоказательствародстваштаммов. ШирокомасштабноеприменениеэтогометодаковсемизолятамвданнойгеографическойзонеможетвыявитьциркулирующиештаммыМБТиидентифицироватьранеенеизвестныеисточникираспростра­нениятуберкулезнойинфекции. Однаковнастоящеевремяещенеустановлено, являетсялитакоеприменениеметодапрактическиосуществимым, посколькулабораторноеизучениеизолятовМБТлегче, чемисследования, необходимыедляотслеживанияраспространенияштаммовсиспользованиемгеномнойдактилоскопии. Методможнотакжеиспользоватьдляподтверждениякросс-контаминациикультуридругихошибок, допускаемыхприлабораторномисследовании.