- •Курсовая работа по дисциплине «Микробиологические методы контроля»
- •Минск 2013 Реферат
- •Содержание
- •Введение
- •1 Основная часть
- •1.1 Характеристика потерь сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов от микробиологической порчи
- •1.1.1 Уровень загрязненности сельскохозяйственного сырья и пищевой продукции микроорганизмами
- •1.1.2 Потери сельскохозяйственной продукции в процессе хранения
- •1.1.3 Способы защиты продукции от микробиологической порчи
- •1.2 Микробиологическая безопасность пищевых продуктов и ее характеристика
- •1.2.1 Показатели микробиологической безопасности пищевых продуктов
- •1.2.2 Требования нормативной документации к микробиологической безопасности продукции
- •1.2.3 Способы повышения микробиологической безопасности пищевых продуктов
- •1.3 Клетки микроорганизмов и их лизис
- •1.3.1 Строение клеточных стенок бактерий
- •1.3.2 Лизис клеточных стенок бактерий с сохранением и подавлением жизнеспособности клеток
- •1. Гомогенизация
- •2. Растирание клеток
- •3. Обработка ультразвуком
- •4. Френч-прессование
- •5. Ферментативный лизис клеток
- •1.3.3 Строение клеточных стенок гриба и их разрушение
- •1.4 Протопласты микроорганизмов
- •1.4.1 Методы получения протопластов микроорганизмов и оценки их выхода
- •1.4.2 Свойства протопластов микроорганизмов
- •1.4.3 Методы слияния протопластов клеток
- •1.4.4 Ревертация протопластов к клеточным формам
- •2 Экспериментальная часть
- •2.1 Материалы и оборудование
- •2.1.1 Микроорганизмы и питательные среды для культивирования микроорганизмов
- •2.1.2 Выделение чистых культур микроорганизмов, устойчивых и чувствительных к тяжелым металлам
- •2.2 Методы анализа
- •2.2.2 Метод получения протопластов микроорганизмов и оценки их выхода
- •2.2.3 Метод регенерации протопластов и оценка выхода регенерантов
- •2.2.4 Характеристика жизнеспособности протопластов и клеток редуктазным методом
- •2.2.5 Характеристика ростовой активности микроорганизмов
- •2.2.6 Определение тяжелых металлов методом комплексонометрии
- •2.2.7 Определение сорбции тяжелых металлов микроорганизмами
- •2.3 Результаты и их обсуждение
- •2.3.1 Получение устойчивых и адаптированных форм микроорганизмов к тяжелым металлам
- •2.3.3 Характеристика сорбции тяжелых металлов протопластами и клетками микроорганизмов
- •Заключение
- •Список использованной литературы
1.3.2 Лизис клеточных стенок бактерий с сохранением и подавлением жизнеспособности клеток
В большинстве экспериментов для выделения и определения внутриклеточных компонентов применяют различные методы разрушения микроорганизмов. Это могут быть ручные и механические гомогенизаторы, растирание клеток с абразивами, растирание замороженных клеток, перемешивание биомассы со стеклянными бусами. Наиболее полное разрушение клеток достигается в случае применения декомпрессионных методов (Х-пресс,Френч-пресс) или ультразвука. Реже применяют осмотический шок и метод замораживания-оттаивания. Описаны также комбинированные методы разрушения микроорганизмов, сочетающие обработку клеточных стенок ферментами с последующим осмотическим шоком полученных сферопластов (протопластов) или растиранием их в гомогенизаторе. В зависимости от вида микроорганизма применяют различные способы их отделения от среды.
Выделяют следующие способы протопластирования:
1. Гомогенизация
Гомогенизацию можно использовать для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой или не имеющих клеточной стенки. Порции биомассы, суспендированные в буферном растворе (3 - 5 объемов), переносят в ручной гомогенизатор и пропускают через него биомассу 10 - 20 раз. При использовании механических гомогенизаторов с быстро вращающимися ножами («блендеров») время обработки обычно не превышает 1—2 мин с интервалами по 20 с промежуточным охлаждением биомассы на льду.
Метод относится к протопластированию с подавлением жизнедеятельности микроорганизмов. Причем, степень разрушения контролируют в фазово-контрастном микроскопе или по количеству белка, высвобожденного из клеток.
2. Растирание клеток
Одним из простых, но достаточно надежных способов разрушения клеток микроорганизмов является растирание их суспензий с абразивами. Для этой цели применяют промытый кварцевый песок, толченое кварцевое стекло, пудру окиси алюминия или другие твердые вещества. При разрушении к клеточной пасте постепенно добавляют двойное количество (по массе) абразива и растирают с силой до появления щелкающих звуков (обычно 10— 15 мин после добавления последней порции абразива). В процессе растирания клеточная паста подвергается нагреву, поэтому дно ступки следует охлаждать (на лотке со льдом). Особо следует отметить способ растирания клеток микроорганизмов, замороженных в жидком азоте, где в качестве разрушающего абразива выступают кристаллики льда, образовавшиеся при быстром замораживании биомассы (вкапывание суспензии в буфере в толстостенную ступку с налитым жидким азотом). При растираниях применяют обычно фарфоровые ступки и пестики. Время обработки зависит от толщины клеточных стенок разрушаемого микроорганизма. Этими способами можно растирать до 30 г сырых клеток за один прием. После растираний к полученной массе добавляют равный объем буферного раствора и центрифугируют для удаления абразивов, неразрушенных клеток и крупных их обломков. Этот способ также относится к методам протопластирования, использование которых приводит к потере жизнеспособности клетки.