2.2.3 Метод регенерации протопластов и оценка выхода регенерантов

В гипертонической среде ММ9 колонии образуют клетки, на которые не воздействует лизоцим, а также протопласты, которые смогли в присутствии осмотического стабилизатора регенерировать клеточную стенку. Подсчитывают количество колоний и рассчитывают исходную концентрацию клеток в культуре, концентрацию протопластов и концентрацию регенерировавших протопластов.

Концентрация протопластов рассчитывается как разность между концентрацией исходных клеток (К_исх) и концентрацией клеток, которые не попали под воздействие лизоцима (К_осм).

Концентрация протопластов, которые регенерировали клеточную стенку, рассчитывается как разность между концентрацией клеток двух типов на гипертонической среде (К_рев) и величиной К_осм.

Эффективность реверсии протопластов в клеточные формы (ЭР) ― это отношение концентрации протопластов, которые смогли регенерировать клеточную стенку, к общей концентрации протопластов:

(2)

2.2.4 Характеристика жизнеспособности протопластов и клеток редуктазным методом

Развивающиеся живые микроорганизмы вырабатывают фермент редуктазу, которая восстанавливает метиленовую синь в её бесцветное лейкосоединение.

Оценку редуктазной активности измеряли по следующей схеме:

1. отмеряли 1 мл раствора микроорганизмов в питательном бульоне и 1 мл раствора протопластов, полученных ферментативным лизисом, разбавляли их 9 мл воды;

2. получали по три разведения по схеме: 0,5 мл полученных растворов и 4,5 мл физраствора;

3. в полученные пробы добавляли 1 мл метиленового синего и засекали время, за которое содержимое обесцветиться.

2.2.5 Характеристика ростовой активности микроорганизмов

Для определения ростовой активности проводили эксперимент в следующей последовательности:

1. отбирали 1 см³ микробной суспензии каждой из культур, приготовленных на основе физраствора, переносили в стерильную пробирку и заливали 9 см³ питательного бульона. Оставляли приготовленный раствор в термостате при 37°С на два часа;

2. измеряли оптическую плотность полученного раствора с периодичностью 1 час, в течение которого культура выдерживалась в термостате.

Ростовая активность микроорганизмов при этом проявлялась через увеличение числа клеток и, как следствие, увеличение оптической плотности исследуемых растворов. Характеристика ростовой активности рассчитывалась по формуле:

(7)

где D – оптическая плотность исследуемой суспензии;

t – длительность периода выстойки (1 час).

2.2.6 Определение тяжелых металлов методом комплексонометрии

Метод комплексонометрии основан на титровании раствора соли тяжелого металла раствором ЭДТА. В работе использовали раствор соли CuCl₂.

Последовательность операций заключалась в следующем:

1. отбирали аликвотный объем анализируемого раствора соли из мерной колбы, прибавляли 2-3 мл буферного раствора с рН равным 10 (аммиачный буферный раствор: 67 г NH₄Clи 570 мл 25%-ного NH₃ в 1 л раствора), 15 мл воды, перемешивали и прибавляли на кончике шпателя индикатор эриохром Т черный;

2. смесь титровали 0,05М раствором ЭДТА до изменения окраски из красной в голубую.

Для точности эксперимента титрование проводили 3 раза, принимая за результат среднее арифметическое. Массу определяемого металла рассчитывали по формуле:

(6)

где - объем раствора ЭДТА, пошедшего на титрование;

- объем аликвоты;

- молярная концентрация ЭДТА;

М – молярная масса определяемого вещества (64 г/моль);

- объем мерной колбы, из которой отбирали аликвоту.