1.4.4 Ревертация протопластов к клеточным формам

В ядре (хромосоме) протопластов содержится вся информация, необходимая для восстановления (регенерации) клеточной стенки и для возвращения их (реверсии) к клеточной форме с характерной морфологией. В большинстве случаев процесс реверсии очень сильно зависит от состава среды. На эффективность регенерации влияет ряд факторов: природа и концентрация осмотического стабилизатора, концентрация агара в среде, наличие, микроэлементов, витаминов и белков-протекторов, температура и pH, уровень клеточного метаболизма.

Выбор того или иного осмотического стабилизатора и его концентрации определяется природой организма. Иногда даже для разных штаммов одного вида оптимальная концентрация и вид осмотического стабилизатора могут отличаться. Очень важным фактором, влияющим на реверсию протопластов, является плотность окружающей среды. В генетических экспериментах жидкие среды для регенерации практически не применяются, поскольку в этих условиях невозможен клональный анализ образующихся рекомбинантов. Кроме того, для эффективной регенерации клеточной стенки, очевидно, необходим контакт цитоплазматической мембраны с каким-либо поддерживающим каркасом. Показано, что реверсия протопластов бацилл и актиномицетов происходит гораздо лучше на средах, содержащих 2% агара, чем на средах с 0,7—0,8% агара. Значительно повышает частоту регенерации применение двухслойного метода. Протопласты ресуспендируют в мягком (0,4-0,7%) агаре или легкоплавкой агарозе и помещают на твердую агаризованную среду (1,5-2% агара). Показано также, что эффективность и скорость реверсии протопластов существенно повышается, если их высевать не на свежеприготовленные, а на частично (на 10-20%) дегидратированные (подсушенные) чашки.Добавление в среду бычьего сывороточного альбумина, лошадиной сыворотки, 0,5% желатина положительно влияет на регенерацию клеточной стенки. Кроме того, эффективность этого процесса зависит от присутствия аминокислот, витаминов и микроэлементов. Вместе с тем. на очень богатых средах уровень реверсии снижается, вероятно, в связи с несбалансированностью процессов роста протопластов и синтеза компонентов клеточной стенки.

Протопласты очень чувствительны к повышенной температуре, и поэтому даже кратковременное ее воздействие резко снижает эффективность реверсии. 

Исследованиереверсиипротопластовбактерийигрибоввыявилосходствопротеканияунихданногопроцесса. Условноонможетбытьразделеннатриэтапа:

1) регенерацияклеточнойстенки;

2) реверсия, появлениеклеток-ревертантов;

3) восстановлениенормальногоцитокинезаипоявлениеклетокисходнойформы.

Вместестемкаждойгруппемикроорганизмовприсущисвоиособенностипротеканияреверсиипротопластов, связанныесостроениемклетокиклеточныхстенок, характеромметаболизмаицитокинеза.

Ревертация бактериальных протопластов

Еслиприобработкелизоцимомилипенициллиномвизотоническойсредеклеточнаястенкасбактериальнойклеткиполностьюнеудалена, топриисключенииэтихагентовизсредыпроисходитбыстроевосстановлениеклеток. Еслижеклеточнаястенкаудаленаполностью, образовавшийсяистинныйпротопластнеспособенвобычныхусловияхеерегенерировать. Однимизусловий, позволяющихтакимформамревертироватькисходномусостоянию, являетсяналичиевсредекультивированиятвердойилиполутвердойосновы. Еюмогутбытьжелатин (5−30 %), агар (0,7−2 %),мембранныефильтры, убитыебактериальныеклеткииликлеточныестенки. Причемиспользованиетвердогосубстратапредпочтительнее.

Ревертация протопластов мицелиальных грибов

Реверсиякмицелиальнымформамугрибныхпротопластовпроисходиткаквжидкой, такинаповерхноститвердойсреды, иливслоеполужидкогоагара. Многиеисследователипоказали, чтореверсиягрибныхпротопластовможетпроходитьтремяспособами, различающимисяхарактеромформированияпервичногомицелия.

Припервомспособепротопластыпервоначальнообразуютцепочкуиздрожжеподобныхклеток (до 20 клеток). Затемтерминальная, ужеосмотическиустойчивая, продуцируетпервичнуюгифу,образующуюмицелий. Второйспособреверсииначинаетсясрегенерациипротопластамиклеточнойстенки, вследствиечегоонистановятсярезистентнымикосмотическомушоку. Послечегопротопластобразуетзародышевуютрубку. Третийспособреверсиигрибныхпротопластовнеобычен. Протопласт, сохраняясферическуюформу, формируетновуюоболочкуввидеполочки, затемтудапереноситсясодержимоематеринскогопротопласта. Еслипоявляетсяцепочкатакихоболочек, тоцитоплазмапередвигаетсяпоэтойцепочке, оставляяпозадисебя«тени»изклеточныхстенок. Последняяклеткацепочкиобразуетпервичнуюгифу. Грибныепротопластымогутревертироватьоднимизтрехспособов, илиуодноговиданаблюдаетсявсетриспособареверсии. Трудносказать, чтовлияетнавыборспособареверсии, возможно, видовыеособенностиорганизма, типегоцитокинеза, методполученияиусловияинкубациипротопластовилисоставрегенерационнойсреды.

Растущиеиревертирующиепротопласты― хорошаямодельдляизучениябиосинтезаклеточнойстенкиивзаимоотношениймеждуростомиядернымделениемклетки.