- •Курсовая работа по дисциплине «Микробиологические методы контроля»
- •Минск 2013 Реферат
- •Содержание
- •Введение
- •1 Основная часть
- •1.1 Характеристика потерь сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов от микробиологической порчи
- •1.1.1 Уровень загрязненности сельскохозяйственного сырья и пищевой продукции микроорганизмами
- •1.1.2 Потери сельскохозяйственной продукции в процессе хранения
- •1.1.3 Способы защиты продукции от микробиологической порчи
- •1.2 Микробиологическая безопасность пищевых продуктов и ее характеристика
- •1.2.1 Показатели микробиологической безопасности пищевых продуктов
- •1.2.2 Требования нормативной документации к микробиологической безопасности продукции
- •1.2.3 Способы повышения микробиологической безопасности пищевых продуктов
- •1.3 Клетки микроорганизмов и их лизис
- •1.3.1 Строение клеточных стенок бактерий
- •1.3.2 Лизис клеточных стенок бактерий с сохранением и подавлением жизнеспособности клеток
- •1. Гомогенизация
- •2. Растирание клеток
- •3. Обработка ультразвуком
- •4. Френч-прессование
- •5. Ферментативный лизис клеток
- •1.3.3 Строение клеточных стенок гриба и их разрушение
- •1.4 Протопласты микроорганизмов
- •1.4.1 Методы получения протопластов микроорганизмов и оценки их выхода
- •1.4.2 Свойства протопластов микроорганизмов
- •1.4.3 Методы слияния протопластов клеток
- •1.4.4 Ревертация протопластов к клеточным формам
- •2 Экспериментальная часть
- •2.1 Материалы и оборудование
- •2.1.1 Микроорганизмы и питательные среды для культивирования микроорганизмов
- •2.1.2 Выделение чистых культур микроорганизмов, устойчивых и чувствительных к тяжелым металлам
- •2.2 Методы анализа
- •2.2.2 Метод получения протопластов микроорганизмов и оценки их выхода
- •2.2.3 Метод регенерации протопластов и оценка выхода регенерантов
- •2.2.4 Характеристика жизнеспособности протопластов и клеток редуктазным методом
- •2.2.5 Характеристика ростовой активности микроорганизмов
- •2.2.6 Определение тяжелых металлов методом комплексонометрии
- •2.2.7 Определение сорбции тяжелых металлов микроорганизмами
- •2.3 Результаты и их обсуждение
- •2.3.1 Получение устойчивых и адаптированных форм микроорганизмов к тяжелым металлам
- •2.3.3 Характеристика сорбции тяжелых металлов протопластами и клетками микроорганизмов
- •Заключение
- •Список использованной литературы
1.4.3 Методы слияния протопластов клеток
Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов ― своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая гибридизация. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки микроорганизмов. Техника парасексуальной гибридизации может позволить:
скрещивание генетически отдаленных видов микроорганизмов;
получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одной из материнских клеток наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другой;
слияние трех и более клеток;
получение гибридов, представляющих сумму генотипов материнских клеток;
перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов;
Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков - скорость деления, устойчивость к патогенам, абиотическим факторам и т. д.
Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов молодых клеток или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических.
Для слияния протопластов используют два основных подхода:
1. Использование полиэтиленгликоля (ПЭГ) в сочетании с высоким рН (9-11) среды и повышенным содержанием ионов кальция Са2+(100-300мМ). Полиэтиленгликоль выполняет роль индуктора слияния, который обеспечивает агглютинацию (слипание). Высокое значение рН и высокая концентрация ионов кальция необходимы для нейтрализации отрицательного поверхностного заряда, который имеют протопласты. В местах слипания происходит разрыв плазмалемм протопластов, приводящий к их слиянию. На этот процесс оказывают влияние, помимо внешних факторов, особенности тканевой принадлежности клеток. Легко сливаются меристемные и каллусные протопласты, менее эффективно сливаются сильно вакуолизированные клетки и клетки с развитыми хлоропластами (например, мезофильные протопласты).
2. Электрослияние протопластов. В этом случае протопласты помещают в неоднородное переменное электрическое поле. В этих условиях протопласты образуют мостик из нескольких клеток между электродами. После пропускания единичных импульсов тока происходит слияние протопластов в результате разрыва их плазмалемм. Эффективность метода слияния протопластов определяют по частоте слившихся протопластов, частоте клеточных клонов, образовавшихся из гибридных клеток, а также частоте образования гибридных проростков. В результате слияния протопластов образуются гомокарионы ― продукты слияния генетически идентичных клеток, и гетерокарионы ― продукты слияния генетически неидентичных клеток.
Далее возможны следующие варианты поведения слившихся протопластов:
синхронное деление двух ядер без их слияния и образование в результате исходных делений двуядерных дочерних клеток;
слияние ядер во время митотического деления и формирование в дальнейшем одноядерных гибридных дочерних клеток.