3. Методы исследования активности ферментов.

В отличие от других биохимических показателей, концентрацию большинства ферментов нельзя определить, т.к. их содержание в биоматериале очень мало. О количестве фермента судят косвенно, по его активности, т.е. по производимому ферментом действию. Активность фермента выражается скоростью уменьшения субстрата, или увеличения продукта реакции (изменение концентрации в единицу времени) в пересчете на количество материала, содержащего фермент. Для определения активности ферментов чаще используют колориметрические и спектрофотометрические методы. Колориметрические методы основаны на измерении оптической плотности окрашенного вещества, образующегося с субстратом или продуктом ферментативной реакции, как правило, после остановки реакции. По способу измерения колориметрические методы являются методами – «по конечной точке» (однократное измерение). Спектрофотометрические методы основаны на измерении изменения поглощения света определенной длины волны субстратом и продуктом реакции. Большинство спектрофотометрических методов определения активности ферментов основано на оптическом тесте Варбурга. Принцип прямого теста Варбурга: при длине волны 340нм восстановленный (НАДН2) имеет максимальное поглощение, а окисленный (НАД) – минимальное, например, Лактат + НАД → ПВК + НАДН₂ (оптическая плотность увеличивается). Используется для определения активности НАД-зависимых дегидрогеназ. Непрямой тест Варбурга используется для определения активности других ферментов и включает измерительную и индикаторную реакции:

Ала + α-кетоглу → глу + ПВК – измерительная реакция

ПВК + НАДН₂ → Лактат + НАД - индикаторная реакция

По способу измерения спектрофотометрические методы могут быть: непрерывные кинетические (определяется изменение оптической плотности субстрата или продукта в единицу времени), двухточечное измерение (определяется изменение оптической плотности субстрата или продукта реакции в начале и в конце ферментативной реакции), по конечной точке.

Методы определения изоферментов

• Электрофоретическиена различных носителях

• Термическое инактивирование(изоЕ ЩФ)

• Ингибирование различными веществами (КФ, ЛДГ1,2)

• Методы, основанные на различном сродстве к субстратам (ХЭ)

4. Единицы измерения ферментативной активности.

За единицу активности фермента принимают такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в единицу времени в расчёте на количество материала, взятого для исследования.

Международная единица активности (E) — это количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в 1 минуту в оптимальных условиях на 1 л биологической жидкости.

Единица активности в системе СИ (катал) — соответствует количеству фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата в 1 секунду на 1 л биологической жидкости.

Соотношение между единицами активности:

1 E = 16,67 нанокатал;

1 катал = 6x10⁷ E.

Удельная активность фермента— это активность, выраженная в единицах активности на 1 мг (или 1 г) белка или 1 мг (1 г) препарата фермента. Используется в биохимической практике.

Распределение ферментов в организме:

1. Е клеточного обмена (органные, тканевые) - это основная масса ферментов, локализованы внутри клеток в цитоплазме клеточных структурах. В сыворотке крови их активность низкая или они вообще отсутствуют. Поэтому увеличение их активности в сыворотке крови имеет клинико-диагностическое значение. К клеточным ферментам относят АСТ, АЛТ, ЛДГ, альдолазу, ГДГ (глутамат ДГ) и др. Клеточные Е синтезируются любой клеткой организма, т.е. органоспецифичностинет, за исключением изоферментов и синтезируемых в печени СДГ (сорбитолДГ), ОКТ (орнитинкарбомоилтрансфераза).

2. Экскреторные Е – это Е, которые синтезируются в клетках и в норме выделяются на «экспорт» Экскреторные ферменты образуются пищеварительными железами и из их секретов поступают в кровь (амилаза, липаза и др.).

Пример

- амилаза синтезируется клетками поджелудочной железы и выделяется в просвет кишечника;

ЩФ синтезируется в печени и выделяется с желчью.

В норме активность этих Е в сыворотке крови низка и постоянна, но если блокируются пути их экскреции, активность в крови возрастает.

3. Секреторные ферменты синтезируются клетками, поступают в

кровь и выполняют специфические функции в кровяном русле, поэтому ихназывают собственно ферментами крови. Это ферменты свертывающей системы и фибринолиза, холинэстераза и др. синтезируются в печенипри патологии органа –«производителя» имеет значение снижение активности этих Е в сыворотке крови.