Лекция 5. Забор, хранение и транспортировка исследуемого материала.

При проведении микробиологических исследований важно своевременно адекватно взять исследуемый материал и доставить его в лабораторию для исследования. Для получения наиболее оптимального ответа при лабораторном исследовании необходимо руководствоваться правилами забора, хранения и транспортировки материала, регламентированными.

Результаты микробиологической диагностики зависят не только от правильного исследования материала, но и в неменьшей степени от соблюдения всех основных правил его забора. Нарушение правил забора, получение нерепрезентативных клинических образцов, неправильная и несвоевременная их доставка в лабораторию--все это снижает достоверность результатов бактериологических исследований, ведет к неверно полученным результатам, что в конечном итоге может нанести вред больному.

Материал для исследования определяется клинической картины заболевания. Учитывается локализация возбудителя на данном этапе патогенеза:

- материал по возможности берется непосредственно из очага инфекции;

- если очаг локализации не ясен, но отмечается резкий подъем температуры, берут на исследование кровь;

- материал надо брать до начала лечения антибиотиками и исключить возможность попадания в него антимикробных препаратов;

-взятие материала необходимо проводить в асептических условиях, строго соблюдая меры безопасности при работе с микробиологическим материалом;

- после забора необходимо в кратчайшие сроки доставить исследуемый материал в лабораторию, оберегая его от воздействия света, тепла, холода, механических повреждений, используя для доставки специальные контейнеры. Оптимальным является первичный посев в месте забора материала

Срок доставки материала в лабораторию не должен превышать двух часов:

- необходимо учитывать, что при длительном хранении материала, происходит гибель наиболее требовательных к определенному составу среды и температурному режиму видов микроорганизмов и размножение менее требовательных и медленно растущих видов, что приводит к нарушению количественного соотношения возбудителя и дезориентирует врача-микробиолога при интерпретации результатов;

- при исследовании на анаэробы биологический материал необходимо поместить в анаэробные условия. Для жидких образцов (кровь, гной, экссудат, жидкости из стерильных полостей) используют специальные флаконы с жидкой питательной средой, заполненные газовой смесью определенного состава. В них уколом иглы через плотно прилегающую крышку вносят материал. Собранный материал доставляют в лабораторию и исследуют в максимально сжатые сроки;

- транспортировка исследуемого материала должна обеспечить сохранение жизнеспособности возбудителя (особенно, если предполагается культуральное исследование) и предотвратить избыточный рост сопутствующей микрофлоры.

- материал забирают в достаточном количестве, которое обеспечивало бы необходимый для исследования объем;

-к исследуемому клиническому материалу, направленному в лабораторию прилагается сопроводительный документ, в котором указывается Ф.И.О больного, время забора материала, предполагаемый диагноз

- при перевозке исследуемого материала за рубеж соблюдают правила по перевозке опасных грузов, в частности, правила установлены для категории проб: диагностический и инфицированный матерниал.

Особенности забора для вирусологического исследования. Исследование на вирусы необходимо проводить не позднее 3-5 дней от начала заболевания.

Эффективность обнаружения вирусов может во многом зависеть от способа взятия исследуемого материала. Если предполагается культуральное исследование, необходимо обеспечить жизнеспособность вируса, поместив материал в соответствующую транспортную среду.

Виду того, что вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, в исследуемом материале должны присутствовать клетки хозяина. Для предотвращения высыхания материала используют транспортную среду для вирусов . Если берут пробы ликвора, крови, мочи, амниотической жидкости или фекалий, транспортная среда не требуется.

В случае хранения проб более 1 часа их следует охладить до 4⁰С (кроме проб крови).

Особенности забора для микологического исследования.

Забор материала проводят в основном, так же, как и для бактериологического исследования.

Материал никогда не замораживать, так как при низких температурах грибы быстро теряют жизнеспособность.

1. При поражении кожи биопсийный материал можно получить с помощью пробойника.

2. Для выделения дрожжевых грибов применяют селективные питательные среды.

3. Материал из стерильных в норме жидкостей (перикардиальной, брюшной, плевральной, синовиальной) после забора концентрируют центрифугированием и для дальнейшего исследования (посева) используют осадок.

Особенности хранения материала для паразитологиеского исследования.

1.СМЖ: забор материала такой же как при бактериологическом исследовании, далее СМЖ помещают в ЭДТА.

2. Хранение материала без консерванта возможно не более 2х часов при комнатной температуре, с консервантом не более 24 часов при комнатной температуре.

Консерванты: жидкость Барбагалло, консервант Турдыева, химические консерванты для консервации и хранения взрослых гельминтов или их фрагментов, консервирующая смесь PVA.Оборудование и среды для взятия материала.

Для взятия и транспортировки биологического материала используют одноразовые стерильные тубсеры (пробирки с тампонами) промышленного производства или транспортные системы со средой. Хранение материала.

Если направить материал сразу же на исследование невозможно:

- пробы хранят при комнатной температуре 18-20⁰С в специальной транспортной емкости, которая представляет собой стерильную одноразовую пробирку с агаризованой или жидкой транспортной средой и зонд-тампом, вмонтированным в пробку и стерильно упакованным с пробкой.

Транспортные среды с активированным углем, используют для сохранения жизнеспособности микроорганизмов, требующих особых условий культивирования (анаэробы, гемофилы, нейссерии, кампмлобактер).

Пробы ликвора необходимо хранить при комнатной температуре 18⁰С - 20⁰С.

Транспортировка материала.

Для транспортировки материала используют:

1.Одноразовые стерильны сухие пробирки с вмонтированным зонд-тампоном (тубусом);

2.Емкости с транспортной средой с вмонтированным зонд-тампоном;

3. Одноразовые стерильные емкости с завинчивающейся крышкой – для сбора мочи, мокроты, фекалий, бронхоальвеолярного лаважа, биопсийного материала;

4. Стеклянные одноразовые пробирки с завинчивающейся пробкой (для сбора стерильных жидкостей).

5.Специальные стерильные урогенитальные или носоглоточные тампоны с осью и тампоны из хлопка или вискозы на конце, которые вмонтированы в пробку, закрывающую стерильную одноразовую стеклянную пробирку. Их используют для забора проб из носоглотки и уретры у мужчин.

6. При исследовании на анаэробы, материал при транспортировке помещают в специальные емкости с транспортной средой.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Микроскопическое исследование. Целью микроскопического исследования является обнаружение в исследуемом материале микроорганизмов. Обнаружение в приготовленном мазке микроорганизмов при некоторых бактериальных (гонорея, туберкулез, возвратный тиф, сифилис), грибковых инфекциях и протозойных (малярия, трихоманиоз, лямблиоз) инвазиях имеет определенное диагностическое значение.

Если при исследовании стерильных в норме жидкостей, при первичной микроскопии выявляют микроорганизмы, это дает возможность постановки предварительного диагноза, назначения и проведения адекватной терапии.

В бактериологических лабораториях применяют не только обычные методы оптической микроскопии в проходящем свете, но и специальные: в темном поле зрения, фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии.

Алгоритм бактериологического исследования:

- первичная микроскопия исследуемого материала (необязательный этап, в зависимости от характера материала);

- первичный посев с целью выделения чистой культуры;

- накопление чистой культуры;

- изучение комплекса биологических свойств выделенной культуры;

- окончательная идентификация возбудителя.

Идентификация выделенной культуры позволяет сделать заключение о том, какой микроорганизм является этиологическим фактором заболевания. При выделении условно-патогенных бактерий необходимо соблюдать критерии этиологической значимости:

- присутствие бактерий в материале из патологического очага в количестве не менее 10⁵КОЕ мл /г;

- повторное выделение из материала той же культуры;

- нарастания титра антител в сыворотке крови больного к аутоштамму в 4 и более раза.

ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Индикация вируса. Вирусы размножаются лишь в живых клетках. В связи с этим культивирование вируса осуществляется в организме животного, куриного эмбриона или в культуре ткани

Культивирование вируса в организме животных. Чаще всего этот метод используют для выделения вирусов, не способных вызывать цитопатическое действие в культуре клеток и не способных размножаться в куриных эмбрионах (некоторые арбовирусы, вирус бешенства, вирусы ящура, вирусы Коксаки, вирусы лимфоцитарного хориоменингита)..

Культивирование в куриных эмбрионах. В тканях эмбриона, его оболочках, желточном мешке размножаются многие патогенные вирусы. При культивировании учитывается тропность вируса к определенной ткани.

Культивирование в культуре ткани. В настоящее время наибольшее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток

Индикация вируса по цитопатическому (ЦПД) действию. ЦПД – это совокупность морфологических и функциональных изменений, происходящих в клетке под влиянием внутриклеточного вируса, приводящих к нарушению метаболизм клеток, прекращению синтеза НК, подавлению синтеза белка.

Индикация вируса по ЦПД. Проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур (монослой клеток). Для этого просматривают под малым увеличением микроскопа сплошной клеточный слой.

Индикация вируса в реакции гемадсорбции. Гемадсорбция – это способность культуры клеток, которая заражена вирусом, адсорбировать на своей поверхности эритроциты.

Индикация вируса по цветной пробе. Цветная проба основана на регистрации изменения цвета среды, которая содержит фенолрот (индикатор) и помещенный в нее исследуемый материал. Если в материале есть вирус, он разрушает клетки монослоя и они становятся неспособнымы к метаболизму. Собственных систем метаболизма вирус не имеет, следовательно, кислых продуктов метаболизма не выделяет, и цвет питательной среды не меняется. Если в материале нет вируса, то клетки монослоя живут, функционируют, выделяют кислые продукты метаболизма, что приводит к изменению цвета среды, она приобретает желтый цвет.

Идентификация вируса до уровня семейства проводят с помощью следующих тестов:

1. Определение типа нуклеиновой кислоты вириона.

2. Определение наличия суперкапсидной оболочки.

3.Определение размеров вириона.

4.Определение наличия или отсутствия гемагглютинина.

5.Идентификацию вируса до вида, внутривидовую идентификацию чаще всего проводят в реакции вируснейтрализации с соответствующими сыворотками.

6.Учет результатов реакции проводится в зависимости от биологии вируса:по результатам РТГА; по цветной пробе; по отсутствию цитопатического действия; по выживаемости чувствительных животных;

- по отсутствию изменений при заражении куриных эмбрионов.

МИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Микроскопическое исследование

Микроскопия – это один из основных методов в лабораторной диагностике микозов. Проводить это исследование необходимо с того дня, когда на питательной среде появляются первые колонии. Перед микроскопическим исследованием необходимо знать является гриб дрожжевым или плесневым – по внешнему виду колоний, результатам проростковой пробы.

При микроскопии плесневых грибов учитывают структуру мицеллия (т.е. особенности строения гиф, их цвет, септированность; особенности строения конидиев и спор, включая размер, форму, цвет конидиев; строение их клеточной стенки, септированность и т.д.)

Для проведения микроскопии готовят нативные и окрашенные препараты. Для приготовления окрашенных препаратов материал обрабатывают различными способами:

1. Окраска PAS-методом . Использование РAS-метода позволяет выявить нейтральные полисахариды в стенках микроорганизмов. Нейтральные полисахариды – это глюкан-маннановый комплекс, находящийся в клеточной стенке большинства эумицетов, за счет него и происходит окрашивание.

PAS-реакции – один из методов микроскопической диагностики тканевых форм грибковой инфекции. В практических лабораториях для микроскопической диагностики используются различные модификации этого метода: окисление хромовой кислоты – реакция Бауэра; окраска по Гридли.

2. Окраска по методу Грама (модификация по Грам-Вайгерту) для выявления сопутствующих микроорганизмов.

3. Окраска по Циль-Нильсону для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов. Если исследуемый материал жидкий, то из него готовят неокрашенный мазок для микроскопии в просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином в соотношении 1:1.

Оценка результатов микроскопического исследования:

1.Если в нативном препарате преобладают только бластоспоры, это расценивается как носительство.

2.Если бластоспоры единичны и преобладает псевдомицелий, то это признаки глубоких органных поражений. Наличие псевдомицелия , который появляется только при взаимодействии гриба с тканью, свидетельствует о глубоких поражениях.

3.Активное почкование бластоспор – свидетельство острого процесса.

Следующий этап это микологическое исследование – выделение и идентификация грибов. Рассмотрим особенности этого этапа в зависимости от исследуемого материала.

Культуральное исследование. Культуральное исследование основано на выделение возбудителя из исследуемого материала. Сроки культивирования различны для разных видов грибов (от 2-4 дней до 4 недель), при подозрении на диморфные грибы культуру выделяют до 8 недель. Основными средами для культивирования в микологической лаборатории является среда Сабуро: декстрозный агар Сабуро (плотная среда), бульон Сабуро (жидкая среда). Для подавления роста бактериальной флоры в среду Сабуро добавляют антибиотики (хлорамфеникол, гентамицин, реже стрептомицин, пенициллин). Для подавления роста сапрофитных грибов в среду добавляют циклогексимид, хлорамфеникол. Существуют готовые среды с циклогексимидом (Mycobiotic Mycosel).

Оптимальным режимом культивирования для большинства патогенных грибов является 30⁰С, 20-25⁰С, реже 37⁰С – при подозрении на диморфные грибы. Длительность инкубации для большинства грибов составляет не более 4 недель; если по прошествию этого времени роста не наблюдается, то дают отрицательный ответ. В случае подозрения на диморфный микоз при отсутствии роста в течение 4 недель, культуру выдерживают 8 недель и только после этого дают отрицательный результат.

При культуральном исследовании диагностически значимым являются:

- выделение любого плесневого гриба, если этот гриб был обнаружен микроскопически;

- выделение плесневого или дрожжевого гриба, при исследовании стерильного в норме материала;

- выделение диморфного гриба;

- выделение грибов рода Cryptococcus;

Алгоритм микологического исследования

1. Определение грибковой этиологии возбудителя (микроскопия).

2. Определяют дрожжевой гриб или плесневый:

- микроскопия клинического материала (наличия мицеллия);

- посев на питательную среду. Для выделения и идентификации грибов используют плотные и жидкие среды Сабуро, сусло-агар. Эти среды обеспечивают рост большинства патогенных и условно-патогенных грибов. Для подавления роста сопутствующей бактериальной флоры в среды добавляют такие антибиотики как хлорамфеникол, стрептомицин, пенициллин. При выделении грибов дерматофитов для подавления роста плесневых грибов, грибов рода Candida,Сryptococcus neoformans в среду Сабуро добавляют циклогексимид. При выделении прихотливых грибов, посевы делают на среды, обогащенные кровью и сердечно-мозговым экстрактом:среда Чапека (для формирования конидий при идентификации плесневых грибов); картофельный и рисовый агары - для выявления получения хламидиоспор при идентификации грибов рода Candida; морковный агар – для получения типичных колоний культуры гриба Trichophyton schonleini; среду Кашкина – для выделения пигментообразующих грибов; ДДС для Сandida albicans – для определения фосфолипазной активности грибов;

- инкубируют грибы от несколько суток (для дрожжевых грибов) до 1 месяца для мицелиальных грибов

- характер колоний на питательной среде, скорость роста (дрожжевые грибы растут 48 часов, плесневые грибы растут медленно). При подозрении на патогенные диморфные грибы для выдачи отрицательного ответа культивирование проводят в течение 8 недель.

3. Окончательную идентификацию гриба до уровня вида (внутривидовая) проводят на основании комплекса культуральных, морфологических, биохимических признаков. При исследовании биохимических свойств изучают способность выделенной культуры к ассимиляции (ауксанограмма) и ферментации (зигограмма). Возможно использование автоматизированных систем идентификации (тест-системы для идентификации грибов).