Лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика направлена на обнаружение возбудителя болезни в том или ином патологическом материале и может быть прижиз­ненной и посмертной. Осуществляется она с помощью бактериологического или серологического методов исследования.

Бактериологическая диагностика. Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют пробы фекалий, взятые от 5-6 больных диареей жи­вотных одной фермы, не подвергнутых лечению антибактериальными препара­тами. Каждую пробу фекалий берут из прямой кишки с помощью предвари­тельно прокипяченного резинового катетера или в момент дефекации в стерильную пробирку в количестве 2-3 г. При взятии материала на свиновод­ческой ферме можно использовать сборные пробы фекалий: в первую проби­рку берут пробы от 2-4 больных поросят одного гнезда, во вторую пробир­ку - от нескольких поросят другого гнезда и т.д.. В случае невозможнос­ти быстрой доставки проб фекалий в лабораторию (через 3-4 ч после взя­тия) особенно в теплое время года их консервируют стерильным 30%-ным водным раствором глицерина в соотношении 1:2.

Для посмертной диагностики в лабораторию направляют 2-3 свежих трупа погибших от диареи или убитых в предагональном состоянии боль­ных животных. При отсутствии возможности доставки цельных трупов посы­лают следующий материал: голову, трубчатую кость; сердце, перевязанное лигатурой вблизи разреза аорты; селезенку, долю печени с желчным пузы­рем, почку. Одновременно с указанным материалом в отдельном целофановом пакете направляют пораженный участок тонкого или толстого отдела ки­шечника, перевнзанный с обоих концов лигатурой на расстоянии .1,5-2 см от места разреза, обязательно с регионарными брыжеечными лимфатически­ми узлами. Материал от каждого трупа животного маркируют и вместе с. соповодительной запиской, доставляют нарочным в лабораторию.

Исследование материала проводят в соответствии о действующими "Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции вызываемой патогенными энтеробактериями", утвержденными ГУБ минсельхозпрода СССР 12 декабря 1991 г.

Перед началом исследования сборных проб фекалий их тщательно размешивают в пробирке стеклянной или металлической палочкой, предварительно профламбированной над пламенем горелки (спиртовки). Пробы фекалий и содержимое кишечника разводят в стерильном 0,85%-ном растворе хлорида натрия 1:20-1:30, затем выдерживают взвеси при комнат­ной температуре 10-15 мин для осаждения крупных частиц, надосадочную жидкость засевают на плотные селективные питательные среды - Эндо, Плоскирева или висмут-сульфит агар (из последних двух сред целесооб­разнее использовать агар Плоскирева, на котором легче выявить колонии на котором легче выявить морганелл и который в большей степени ингибирует рост протея). До начала посевов плотные селективные среды в чашках подсушивают в термос­тате. При исследовании фекалий, консервированных глицериновым раствором, их в начале тщательно размешивают в консерванте, а затем разводят в 5-10 раз в стерильном физиологическом растворе, после чего засевают на плотные селективные среды.

Патологический материал от погибших или убитых с диагностической целью животных (за исключением содержимого кишечника) засевают в пробирки с МПБ, на скошенный МПА, агар Эндо, Плоскирева или висмут-сульфит агар. Для исследования голов­ного мозга на голове делают трехугольный распил черепной коробки или к мозгу, трубчатую кость распиливают или разрубают топором.

Посевы материалов в МПБ и на скошенный МПА проводят пастеровскими пипетками, посевы на плотные среды в чашках - путем отпечатков раз­резанной поверхностью органа из предварительно профламбированного участка или вносят материал пипеткой на поверхность питательной среды, а затем равномерно растира­ют его стеклянным шпателем. Разведенные фекалии и содержимое кишечника засевают петлей широкими, частыми штрихами по всей поверхности среды в чашке. Засеянные пробирки и чашки инкубируют при температуре 37-38 С в течение 18-24 ч. При наличии в МПБ равномерного помутнения культуру микроскопируют (окраска по Граму) и в случае обнаружения мелких грамотрицательных палочек с закругленными концами, не образующих спор и капсул, пересевают её на агар Эндо, Плоскирева или висмут-сульфит агар в чашках, которые затем помещают в термостат (37-38 С) на 18-24 ч. Пере­ресев бульонных культур на плотные селективные среды проводят в том случае, если отсутствует рост колоний на этих средах в первичных посевах из соответствующих органов и тканей.

Выросшие в чашках на агаре Плоскирева и Эндо мелкие полупрозрач­ные колонии лактозоотрицательных бактерий, имеющие S-форму, с голубо­ватым оттенком или серовато-голубоватого цвета, а на висмут-сульфит агаре зеленовато-оливкового цвета пересевают на скошенный МПА (по 1-2 коло­нии с чашки). В случае роста указанных колоний в посевах из нескольких органов и тканей трупа животного пересев делают с культур, полученных не менее, чем из двух органов и тканей.

Первичные культуры на скошенном МПА и агаровые культуры, полученные после пересева колоний лактозоотрицательных бактерий с культур на плотной селективной среде в чашках, микроскопируют (окраска по Граму) и при наличии в мазках мелких грамотрицательных палочек с закругленными концами, не образующих спор и калсул, располагающихся одиночно и по­парно, подвергают дальнейшему изучению с целью родовой и видовой иден­тификации, а также определения патогенных свойств или серогрупповой принадлежности.

Видовую принадлежность культур устанавливают на основе определения морфологических и культурально-биохимических свойств, патогенные свойства - в биопробе на белых мышах (внутрибрюшинное заражение в дозе 500 млн. м.к.), серологическую принадлежность – в пластинчатой и пробирочной РА, для постановки которой используют набор нативных морганеллезных агглютинирующих серогрупповых сывороток в соответствии с наставлением по их применению, утвержденному Департаментом ветери­нарии Минсельхозпрода России 4 апреля 1997.

Культуру относят к патогенной в случае положительного результата биопробы ли установления ее принадлежности к одной из эпизоотических серогрупп морганелл, вызывающих заболевание у молодняка животных. При выделении культур морганелл из селезенки, крови сердца, костного и головного мозга (не менее чем из двух перечисленных органов) животного патогенные свойства этих культур не определяют и их сероло­гическую типизацию не проводят; такие культуры относят к возбудителю болезни. При необходимости определяют антибиотикочувствительность выделен­ных штаммов в соответствии с “Методическими указаниями определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней животных”, утвераденными ГУБ МСХ СССР 30 октября 1971 г.

Общий срок бактериологического исследования до 7 суток.

Диагноз на заболевание ставят на основании совокупности эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических измене­ний и положительного результата бактериологических исследования патологического материала.

Серологические методы ускоренной индикации морганелл.

Для ускоренной индикации эпизоотических штаммов морганелл в патологическом мате­риале, кормах, объектах внешней среды Л.С. Каврук (1987) предложил исполь­зовать реакцию нейтрализации антител (РНАт), с помощью которых представляется возможность обнаруживать искомые бактерии в первичных культу­рах в течение 6-7 часов независимо от присутствия в них посторонних микроорганизмов, что исключает необходимость получения чистых культур морганелл с последующим изучением у них морфологических и культурально-биохимических свойств с целью видовой идентификации, а также опреде­ления патогенных свойств в биопробе на белых мышах. Данная реакция отличается высокой чувствительностью и специфичностью и не требует подтверждения полученных результатов бактериологическим методом. Для постановки РНАт применяют разработанный автором и изготовленный биоприятием набор морганеллезных эритроцитарных диагностикумов совместно набором морганеллезных агглютинирующих серогрупповых сывороток к 8 серогруппам морганелл, наиболе часто вызывающим заболевания у телят и поросят. Подготовку материалу для исследования и постановку самой ре­акции осуществляют в соответствии с “Методическими указаниями по уско­ренной индикации эпизоотических штаммов морганелл в разных объектах с помощью реакции нейтрализации антител” и наставлением по применению набора морганеллезных эритроцитарных диагностикумов, утвержденными Депортаментом ветеринарии Минсельхозпрода России.

РНАт относится к 3-х компонентным серологическим реакциям и про­ходит в две фазы. В первой фазе (визуально невидимой) участвуют искомые бактерии (О-антиген морганелл), содержащиеся в исследуемом материа­ле, и специфические антитела морганеллезных агглютинирующих О-сывороток. Во второй фазе реакции принимают участие морганеллезные эритроцитарные диагностикумы, гомологичные серогруппам сывороток. При наличии в иссле­дуемом материале искомых бактерий последние связываются со специфическими антителами агглютинирующей сыворотки (1-ая фаза) и после добавления к указанным компонентам морганеллезного эритроцитарного диагностикума (2-ая фаза) гемагглютинации не происходит - положительный резуль­тат РНАт. Если в исследуемом материале отсутствуют искомые бактерии, то антитела специфической сыворотки остаются свободными в 1-ой фазе реакции и связываются с морганеллезным гомологичным диагностикумом, ввиду чего во 2-ой фазе реакции происходит аггютинация эритроцитов, которые выпадают в осадок .имеющего вид “зонтика” - отрицательный ре­зультат РНАт. Реакцию проводят в стандартных полистироловых пластинах с лунками. Одновременно с постановкой реакции подвергают контролю гемагглютинирующую активность сывороток в рабочих титрах и исследуемый материал.

В качестве ускоренного сигнального метода индикации эпизоотичес­ких штаммов морганелл С.В. Бритова (1987) рекомендует использовать реакцию коагглютинации (РКОА), для которой автором были изысканы оптималь­ные условия получения высокоактивных морганеллезных коагглютинидующих диагностикумов. Приготовление диагностикумов проводят согласно “Методическим указаниям по ускоренной индикации морга­нелл, сальмонелл и энтеропатогенных эшерихий с адгезивными антигенами К88 и К99 в объектах внешней среды, кормах и патологическом материале при помощи реакции коагглютинации”, утвержденными ГУВ Госагропрома СССР 18 января 1989 г. В соответствии с ними на стеклянной пластине смеши­вают каплю суспензии культуры бактерий, выращенной на плотной селективной среде, или каплю первичной культуры в жидкой питательной среде (обо­гащения, накопления или МПБ) с каплей коагглютинирующего диагностикума, результаты реакции учитывают через 1-3 минуты по наличию или отсутствию хлопьев и степени просветления жидкости. Большая чувствительность реа­кции, простота в технике выполнения и доступность любым лабораториям позволяет рекомендовать ее для повседневной диагностической работы.