2.1.Обєкт та предмет досліджень

Об’єктом дослідження: є водна рослина роголистник темно-зелений. Роголи́сник зану́рений (Ceratophyllum demersum), роголи́стник темно-зеле́ний або роголи́стник підводний(рис.1) – багаторічна водяна рослина, найпоширеніший вид роголисників - зустрічається на всіх континентах, крім Антарктиди. Може рости на великій глибині – до 9 метрів. Стебло – довге, тонке, у верхній частині – гіллясте, всипане маленьким голкоподібним листям яскраво або темно-зеленого кольору.

Рис. 1.Роголи́стник підводний

Коріння у роголисника немає. Його роль виконують особливі бліді, майже безбарвні гілки в нижній частині стебла. Вони проникають в мул і утримують рослину. Поживні (мінеральні) речовини поглинає вся поверхня роголисника - стебло і листя, а не коріння, як у більшості інших рослин. Квітки – дрібні, ледве помітні, без пелюсток. Тичинкові і маточкові квітки розташовані на одній рослині. Роголисник все життя проводить у воді, запилюється – теж під водою. Дозріваючи, тичинки відділяються від квітки і спливають на поверхню, де пилок висипається з пиляків. Пилок важчий за воду, тому опускається і потрапляє на приймочки маточок. Водне запилення – рідкісне явище у світі рослин. Плід – горішок, має три шиповидні виступи. Восени, коли температура знижується до 12 – 14°С, більша частина рослини відмирає, а верхівки пагонів з бруньками опускаються на дно водойми, де і зимують.

Рис.2. Роголисник занурений

Росте як на сонці, так і в тіні, але яскравого сонячного світла не любить. Прагне «піти» на глибину або в тінь дерев, що ростуть на березі. Мешкає у водоймах із стоячою або повільно проточною водою. Краще росте у помірно жорсткій воді, що має нейтральну або слаболужну реакцію. Дуже невибагливий. Добре витримує широкий діапазон температур – від 12 до 30°С, але в теплій воді розвивається значно швидше. Роголисник занурений (рис. 2) зустрічається на всіх континентах, крім Антарктиди. Інколи витісняє з водоймища інші рослини. По річці, яка заросла роголисником, нерідко важко плисти на човні.

Значення.

Підводні луги з роголисника відіграють важливу роль в житті водоймища. Вони слугують притулком для риб і дрібних безхребетних. Також очищають воду і насичують її киснем. Роголисником харчуються деякі риби, равлики; він також придатний для використання в акваріумах. Роголисник занурений і препарати з нього в народній медицині застосовували при жовтяниці, артеріальній гіпертонії, укусах отруйних комах, при кривавій блювоті, як пом'якшувальні і жарознижуючі засоби, у тому числі при малярії.

2.2. Методики отримання і застосування препаратів

Екстракційне очищення.

1. Рослинний матеріал гомогенізують і екстрагують гормони 80% - ним етанолом у співвідношенні 1:10 протягом 16-20 годин при температурі 4 ° С.

2. Потім протягом 1 хвилини матеріал перемішують (наприклад, на гойдалці) і осад відокремлюють цантрифугуванням або фільтрацією.

3. Спирт упарюють, а водний залишок доводять водою до 15 мл і закисляють I н соляною кислотою до рН = 2.

4. До воднії фази додають 5 мл діетилового ефіру, перемішують погойдуванням, чекають поділу фаз і збирають ефірну фазу (ефір-зверху), де міститься ІУК і АБК.

5. Операцію повторюють, додавши до воднії фази 3 мл ефіру.

6. До сумарного ефірного екстракту додають 4 мл 1% бікарбонату натрію, знову перемішують, чекають поділу фаз і відкидають ефірну фазу.

7. При цьому ІУК і АБК знаходяться в розчині соди. Разом з ефіром видаляються імунореактивності нейтральні похідні гормонів, які заважають визначенню вільних форм.

8. Розчин соди закисляє 1 н НС1 (до рН = 2) і двічі екстрагують ефіром (по 2 мл ефіру кожного разу).

9. Після упарювання ефіру або бутанолу (в залежності від типу гормону) зразки розчиняють в 100 мкл 80%-ного етилового спирту.

10. 0,1-1 г вихідного рослинного матеріалу зазвичай достатньо для визначення ІУК, АБК і цитокінінів в 5-ти аналітичних повторностях кожного гормону.

11. Екстракцію гіберелінів проводили етилацетатом (1:3 по об’єму) при рН 2,5, підкислення – 1н HCl.

12. Для визначення активності синтезу гіберелінів застосовували специфічні біотести - гіберелінів – мезокотилі кукурудзи гібриду Росава.

13. Визначення вмісту фітогормонів у культуральній рідині проводили методом кількісної тонкошарової хроматографії [8].

14. Попереднє очищення та концентрування етанольного екстракту проводили на хроматографічних пластинках марки Silufol UV254 («Chemapol», Чехія).

15. Експрес-очищення включало наступні кроки хроматографування: 1) у хлороформі, 2) в NH3 12,5 %, 3) у системі розчинників: етилацетат – оцтова кислота (20:1).

16. Зони, що співпадали з Rf нанесених стандартних розчинів, зчищали скальпелем та елюювали етанолом.

17. Для хроматографування гіберелінів використали пластинки з окисом алюмінію («Merck» № 5713). Система розчинників для гіберелінів: н-бутанол – оцтова кислота – вода (4:1:5).