Тема лекции №11 Структура и функции клетки

План

1. Изучение структуры клетки.

2. Подвижность бактерий.

3. Таксисы.

Изучение структуры клетки

Включения в бактериальной клетке. У бактерий, которых изучали под микроскопом еще в XVIII веке, были обнаружены тельца, хорошо преломляющие свет, значение которых было неизвестно. Эти включения описал Эренберг в 1838 году как Monas okenii. Так как он отнес эти гигантские бактерии к «маленьким животным», родственникам простейших (Protozoa), он соответственно и описал эти структуры следующим образом:

С такой фантазией позднее уже никто не описывал внутренние структуры бактерий. Природа веществ в клетке бактерий, различимых под микроскопом в виде гранул и капель, интересовала ботаников с 1880 года. Они установили с помощью микрохимических реакций, что в клетках водорослей, грибов, листьев, семян и плодов содержатся нейтральные жиры, полисахариды, запасные белки.

Полисахариды. С помощью йодистого калия П. Ван Тигем уже в 1877 году установил наличие у Bacillus amylobacter голубых телец крахмала, и Бейеринк в 1893 году у Granulobacter polymyxa - коричнево окрашенных гранул гликогена. У многих бактерий, описанных в последующие 60 лет, был обнаружен либо крахмал, либо гликоген; в большинстве случаев гранулы были очень малы и неразличимы. Escherichia coli была, по-видимому, забыта. Обнаружение у Е. coli большого количества гликогеноподобных полисахаридов (полиглюкозы) явилось неожиданностью.

Поли-β-гидроксимаслянаякислота. При использовании липидофильного красителя судан III удалось установить у бацилл и Azotobacter chroococcum «жировые тельца». Артур Мейер уже в 1899 и 1912 годах заметил, что в вегетативных клетках некоторых видов бактерий при обработке eau de gavelle (щелочной водой) происходит почти полное растворение включений, за исключением жироподобных гранул. Карл Стапп (1888-1984), обнаружив в 1924 году растворимость жиров Azotobacter в хлороформе, не смог, однако, выяснить их химическую природу. Идентификацией жировых телец как поли – β - гидроксимасляной кислоты мы обязаны случайной находке Лемуаня (1926, 1927). Суспензия Bacillus megaterium была оставлена им в дистиллированной воде в отсутстние доступа воздуха, в результате чего последовало выделение кислоты. Кислота была идентифицирована как β -гидроксимасляная и как исходный продукт поли- β -гидроксимасляной кислоты. Так продолжалось до 1943 года, пока не было установлено сходство между полимерами, открытыми у В. megaterium, и жиром, накапливающимся у Azotobacter chroococcum, но это сообщение вышло на французском языке и долгое время оставалось неизвестным широкому кругу ученых. И только благодаря одной публикации Макре и Вилкинсона (1958)¹⁶⁴ ПГБ (полигидроксибутиловая кислота) стала известна в странах, где не были знакомы с франкоязычной литературой. С тех пор ПГБ в большом количестве была обнаружена у многих бактерий как резервное вещество.

Гранулы полифосфата. Химическая природа полифосфатных гранул, широко распространенных у водорослей, грибов и бактерий, стала известна с 40-х годов XIX столетия. А. Мейер, который обнаружил эти гранулы у Spirillum volutans, назвал их волютиновыми гранулами. Он описал эти гранулы по негативным признакам: не окрашиваются йодом и суданрот, не растворимы в органических растворителях, растворимы в воде и щелочи и в eau de gavelle. Он предположил, что это резервные вещества белкового характера или нуклеиновые кислоты. «Если волютин действительно имеет отношение к нуклеиновым кислотам, что, вероятно, следует из моих микрохимических исследований, то он содержит наряду с Н, О и С [...] еще и N и Р» (Меуег, 1912). Но попыток определить состав волютина не было им предпринято.

Полифосфатные гранулы были первыми включениями, описанными у бактерий. Бейбс (1889) и Гилермон (1903) сообщили о существовании до тех пор еще не известных включений у микро- и коринебактерий и рассматривали их как метахроматиновые гранулы. Метахроматиновая реакция основывается на сдвиге абсорбционного максимума основных красителей в коротковолновой области, в случае толуидинблау - между 630 и 530 нм, вследствие образования комплекса молекул полифосфатов. Несмотря на появление многочисленных работ о гранулах волютина, никаких успехов относительно их химической природы достигнуто не было. Только в 1947 году И. М. Вейм выделил это вещество из дрожжей и идентифицировал его как неорганический полифосфат. А полимер неорганического фосфата выделил Либерман из дрожжей уже в 1888 году. Заслуга Вейма состоит однако в том, что он объединил цитологические и химические данные и установил, что давно известные метахроматические тельца, волютиновые гранулы и отложения полифосфатов в клетке представляют собой одно и то же.

Эндоспоры. После того как было установлено исследованиями Ф. Кона (1872, 1877) на Bacillus subtilis и R. Коха (1876) на Bacillus anthracis существование термоустойчивых эндоспор, за короткое время было описано много спорообразующих бактерий. А. Пражмовски (1880) изучал образование спор на культурах В. subtilis и Clostridium butyricum. Сильное преломление света, которое Кон приписал высокому содержанию жира, основывается на содержании плотных веществ. Исследователя интересовали форма и величина спор, их положение в материнской клетке, процесс спорообразования, их освобождение, деление спор, теплоустойчивость, устойчивость к химическим веществам, облучению и тому подобное. Во многих работах имелись рисунки. В распоряжении исследователей уже находились микро­скопы с апохроматической оптикой и масляной иммерсией и целый ряд реагентов для осветления, протравливания и окраски. К числу тех, кто использовал необычные свойства микроскопа, принадлежал Артур Мейер и Марбурге. Он уже в 1897 году описал Bacillus (Astasia) asterosporus, которая потом оказалась идентичной В.polymyxa, и представил рисунок споры: в виде бочонка в длину и со звездообразным поперечником. Позднее ван ден Гооф и Анинга (1956) в работе, сделанной на основе электронной микроскопии, смогли подтвердить наблюдавшиеся Мейером структуры и с удивлением констатировали: «Мейер Пыл необычайно проницательным наблюдателем». Кроме него, ни один микроскопист, наблюдавший позднее споры В. asterosporus, не был в состоянии обнаружить эти детали. В остальном же удивительно, как мало к 1950-м годам было известно о спорах.

Параспоры. У некоторых аэробных спорообразующих бактерий можно выявить специфические включения ромбовидной формы. Первым описал у Bacillus такие тельца в 1911 году Э. Берлинер, назвавший их «покоящимися тельцами». Саму бактерию он выделил из больной личинки мучной моли (Ephestia kiihniella). Пробы были взяты в 1909 году изтюрингской муки, что было установлено по взятым пробам исследовательской лаборатории по обработке зерна в Берлине, куда были посланы эти образцы. Берлинер назвал болезнь «сонливостью» (Schlaffsucht), а у возбудителя болезни Bacillus thuringienis (1911, 1915) он описал образование ромбовидных телец, которые сопровождают процесс спорообразования, и предположил, что они возникают из содержимого клетки, которое не используется для образования спор. Однако ни он, ни О. Маттес (1927) в Марбурге не установили связи между болезнью и параспоральными включениями. Но уже в 1902 году Ишивата в Японии выделил из больных шелковичных червей (Bombyx mon) бактерию, которую назвал Bacillus sotto. Аоки и Шигасаки (1915) обнаружили, что ее клетки во время спорообразования образуют токсическое вещество. Болезнь шелковичных червей уже описал Пастер в 1870 году как «flacherie». А возбудитель впервые был выделен и описан К.Тумановым и К.Ваго в 1951 году и назван Bacillus cereus var. alesti. Кристаллические включения первыми наблюдали Э. А. Стейнхауз (1954) в Англии и Т.Ангус в Канаде. На возможность использования бактерий типа В. thuringiensis для биологической борьбы с вредными насекомыми впервые указал Стейнхауз (1951). Однако выделение новых штаммов и исследование их патогенности быстро пошло вперед и довольно скоро стало использоваться в практике.

Рибосомы. Открытие рибосом последовало после того, как в распоряжение микробиологических лабораторий поступила новая техника, такая как мощные центрифуги, ультрацентрифуги, радиоактивная маркировка. Деятельность Д. Д. Уотсона в Гарвардском университете и Р. Б. Робертса в Вашингтоне, начиная с 1957 года, привела от первых систематических исследований о рибонуклеопротеиновых частицах, определения их размеров и разделения по размерам к раскрытию их участия в синтезе белка.

Газовые вакуоли. Структуры, называемые в настоящее время газовым вакуолями, которые в большом количестве находятся в аноксигенных и оксигенных фототрофных бактериях, были впервые описаны Виноградским в 1888 году у Lamprocystis roseopersicina. Структуры, «которые выглядят как образование, наполненное воздухом в воде», Виноградский назвал «полостью». Он напомнил слова Ф. Кона, который видел клетки, «производящие впечатление пустых». Разные авторы давали этим I образованиям различные названия: газовые вакуоли (Klebahn, 1895), аэросомы - висящие тельца (Molish, 1903), псевдовакуоли (Lauterborn, 1915). Первые сведения о том, что вакуоли содержат газ, представили Г. Клебан (1895) и его сотрудник С. Стродтман (1895). Оба провели опыты с Gloiotrichia, и Стродтманн был первым, кто смог подвергнуть давлению эти вакуоли. В классическом опыте «Hammer, Kork und Flasche» (молоток, пробка и сосуд) было показано, что газовые вакуоли исчезают, если клетки подвергаются сильному давлению. Из этого и последующих экспериментов Клебан сделал вывод, что вакуоли содержат газ, вероятно азот, и окружены мембраной. Первые электронно-микроскопические снимки газовых вакуолей были сделаны на Halobaderium halobium. А то, что они состоят из скоплений и штабелей газовых пузырьков, было обнаружено в 1960-е годы (Bowen, Walsby).

Бактериальное ядро. Вопрос о том, имеют ли бактерии клеточное ядро, был поставлен, когда существование бактерий было твердо установлено, а с 1900 года эта проблема стала разрабатываться. Осложняли задачу недостаточные знания о составе ядерного вещества, хроматина. Существование двух нуклеиновых кислот стало известно с 1938 года. Для цитохимического доказательства существования хроматина надо было различать ДНК и РНК. Определение локализации гранул, содержащих ДНК, в бактериях началось после того, как Р. Фёльген и Войт (1924) установили, что ядра животных и растений можно окрасить основным фуксином в темно-фиолетовый цвет, если перед окраской нагревать препарат 1 N НС1 в течение четырех минут при 60°. Эта ядерная «реакция Фёльгена» основывается на освобождении сахарного альдегида из ДНК. Войт (1925-1927 годы) получил положительные результаты на бактериальных штрихах. К. Печман и А. Риппель (1932), а также Г. Пекарски и Б. Штиль (1937) осуществляли нуклеиновую реакцию на бактериях и дрожжах. К. Ф. Робиноу (1942, 1953) проследил морфологические изменения в ядрах во время клеточного деления, применил окраску Гимза и другие методы окраски и прояснил некоторые детали. Используя ферментативный гидролиз ДНК и РНК, а также белков с помощью ДНКазы, РНКазы и пепсина, Д. Петере и Р. Виганд (1953) доказали, что гранулы, которые благодаря окраске становятся видимыми, являются ДНК. Электронно-микроскопические исследования тонкой структуры на ультратонких срезах бактерий требовали больших усилий (Maaloe, Birch-Andersen, 1956), которые остались в тени из-за достижений в генетических исследованиях (Lederberg, 1947). Только возможность видеть хромосомы с помощью авторадиографии после введения ³Н-тимидина и обнаружения двойной спирали ДНК (Cairns, 1963) дало ответ на вопросы, поставленные цитологами.

Бактериальная стенка. То, что бактериальные клетки имеют клеточную стенку, было известно с времен Кона (1875). Исследования Е. Клиенбергер-Нобель (1935), описавшей α-формы Streptobacillus moniliformis и других бактерий, выделение Вейбулом (1953) с помощью лизоцима протопластов без клеточной стенки и исследования сферопластов, полученных с помощью пенициллина, подтвердили наличие клеточной стенки у бактерий. Хорошо организованные исследования бактериальной клеточной стенки были начаты разработкой методов выделения основных структур M. Р. Салтоном и Р.В. Горном (1951). Салтон (1952) обнаружил также разрушение изолированной клеточной стенки лизоцимом. Обнаружение того, что штаммы Staphylococcus aureus под действием пенициллина выделяют хорошо адсорбирующие ультрафиолетовый свет вещества, «парк-нуклеотиды», и выяснение структуры УДП-ацетилмурамовой кислоты стали началом успешных, ведущихся в хорошем темпе непрерывных исследований для выяснения химического строения гетерополимерных макромолекул клеточной стенки бактерий. Изучение структуры и разработка концепции о том, что основу клеточной стенки представляет «мешковидная макромолекула» (murein sacculus) - это заслуга тюбингского вирусолога Вольфхарда Вейделя (1916-1965). В остальном идентификация компонентов этого пептидо-глюканового остова является работой не одного исследователя, а совместных усилий вирусологов, физиологов бактерий, биохимиков и химиков.

Липополисахариды. С помощью серодиагностических исследований, которые с начала XX столетия в больших масштабах проводились на животных, растениях и микроорганизмах, были также исследованы липополисахариды (ЛПС) - О-антигены, ответственные за эндотоксические свойства энтеробактерий. По серологической реакции в роде Salmonella различаются сотни штаммов, и Б.Уайт (1931) и Ф.Кауфман (1937) разработали основные положения Кауфмана - Уайта схемы. Эта классификация серологических свойств является работой всей жизни Фрица Кауфмана; он выполнил важную задачу в медицинской диагностике и эпидемиологии. Уже в 1945 Карл Ландштайнер указал, что специфичность реакции антител должна основываться на различии полисахаридов. С целью изучить 0-специфичные гетерополисахариды химическими аналитическими методами, О. Вестфаль и О.Людериц (1952) начали анализировать большое число ЛПС новыми методами и описали большое число новых Сахаров и их связи, и подтвердили серологически обнаруженную разницу. С тех пор с помощью ЛПС можно охарактеризовать почти все грамотрицательные бактерии.