Тема лекции №9 Азотфиксирующие бактерии

План

1. История открытия.

2. Изучение механизма фиксации молекулярного азота.

3. Многообразие азотфиксирующих бактерий.

История открытия

Многовековой опыт земледелия, показавший, что возделывание бобовых растений положительно влияет на плодородие почвы, был подтвержден затем исследованиями Жана Баптиста Буссенго (1837, 1838) по обогащению почвы азотом.

Клубеньки, которые можно видеть как вздутия на корнях бобовых растений, наполненные бактериями, похожими на палочки, впервые обнаружили Э.Лахман (1858) и М.Воронин (1866). Позднее эти «нетипичные» бактериальные формы были названы И. Брунхорстом (1885) «бактероидами». Ученые наблюдали, как эти клубеньки образуются в результате инфицирования подвижными бактериями. Затем А. Франк (1879) показал, что они возникают в результате попадания инфекции из почвы. Однако заслуга окончательного раскрытия связи между образованием клубеньков и связыванием молекулярного азота принадлежит Г. Гельригелю (1831-1895) и Г. Вильфарту (1884-1886). Проведенные ими с исключительной тщательностью опыты показали, что клубеньки на корнях образуются в результате инфицирования корней бактериями, и что именно эти клубеньки обеспечивают растения азотом. В чистую культуру эти бактерии были выделены М. В. Бейеринком в 1888 году и вначале названы им Bacillus radicicola Обнаружение высокой специфичности клубеньковых бактерий в отношении бобовых растений и их широкого распространения в почвах - это заслуга Э. Б.Фреда, И. Л. Болдуина и Э. Мак Коя (1932).

Открытием же свободноживущих, фиксирующих азот бактерий человечество обязано Виноградскому (1894). Он вносил почву в питательный раствор, содержащий сахар без какого бы то ни было источника связанного азота, и наблюдал, как раствор становился мутным, а затем начинал пахнуть масляной кислотой. Он выделил оттуда Clostridium pasterianum и обнаружил его способность фиксировать N2. Но Виноградский не обратил внимания на образование поверхностной пленки бактерий, и таким образом позволил открыть Azotobacter chroococcum Бейеринку и ван Дельдену (1902).

Изучение механизма фиксации молекулярного азота

Дальнейшие исследования по фиксации N2 бактериями были посвящены изучению механизма фиксации. В этом особо большое участие принимал Отто Мейергоф (1884-1951). Работами Мейергофа и Дина Барка началась новая эра в исследовании фиксации N₂. Микрореспирометрия позволила осуществить точное определение количества фиксируемого азота и эффективность фиксации на единицу органического вещества простыми средствами. Эти данные привели к развитию теоретических основ и критической оценке физиологических опытов. Мейергоф и Барк измерили зависимость фиксации N2 азотобактером от парциального давления кислорода и установили, что наибольший выход микробной биомассы достигается при концентрации кислорода около 4 %. Для построения кривой фиксации N2 Барк применил уравнение Михаелиса для энзиматических реакций. В своих опытах он впервые использовал молекулярный жидкий водород. По результатам этих опытов он установил, что константа Михаелиса по азоту составляет 0,21 атм. С целью получения кинетических данных и для расчета константы Михаелиса для азота он преобразовал степенную функцию в прямое уравнение и установил основные параметры роста. В дальнейшем этот метод, предложенный Лайневивером и Барком (1934), способствовал развитию исследований по кинетике энзимов.

В тот же период, когда Мейергоф и Барк проводили свои исследования по Azotobacter chroococcum, в министерстве сельского хозяйства США в Мэдисоне работали по симбиотической фиксации N₂. Поскольку первоначально опыты по фиксации N₂ ризобиями в чистой культуре не дали однозначных результатов (1931), то такие исследования были проведены с большим размахом в вегетационных опытах с клевером. Клевер был посажен в девятилитровые сосуды, наполненные прокаленным песком и питательным раствором, не содержащим азота. Чтобы измерить константу Михаелиса, парциальное давление кислорода поддерживалось постоянным на уровне 0,20 атм, а парциальное давление N₂ варьировалось. В качестве восстановителя использовался молекулярный водород. Когда однажды водород случайно забыли ввести, растения стали расти значительно лучше. Проведенные затем опыты с аргоном и гелием показали, что водород специфически подавляет фиксацию N₂ (Wilson, 1936, 1938). Группа Барка подтвердила эти данные, и в 1940 году они сообщили, что Н2 специфически тормозит связывание N2 также и у Azotobacter vinelandii. На основании задержки фиксации N2 свободным водородом был сделан вывод о том, что бактерии, фиксирующие азот, должны иметь гидрогеназу. Водород (Н2) задерживает фиксацию N2 у азотобактера, клостридий и бобовых растений. Позднее у A. vinelandii, A. agile и у клубеньковых растений была выявлена гидрогеназа. Нитрат как легкодоступный источник азота снижает активность гидрогеназы. Это положение привело к следующему заключению: если все фиксаторы азота содержат гидрогеназу, тогда среди бактерий, имеющих гидрогеназу, должно быть много фиксаторов азота. Этот вывод способствовал расширению поиска большого числа гидрогеназоактивных бактерий, и в 1949-1953 годах было обнаружено большое число видов бактерий фиксаторов азота.

После открытия Гельригеля и Вильфарта способность фиксировать N₂ была обнаружена у фототрофной бактерии Rhodospirillum rubrum. За короткое время фиксация азота была выявлена и у других фототрофных бактерий. Бейеринк уже в 1901 году сделал заключение о способности цианобактерий (Anabaena, Nostoc) фиксировать N2. Цианобактерий были найдены в полностью свободной от азота воде горячих источников Йеллоустоунского национального парка еще в 1928 году. После того как в эту воду была внесена почва, в ней развились только синезеленые водоросли. Из этого было сделано заключение о том, что цианобактерии могут связывать азот.