Вопрос 9

Разливка питательных сред

Питательные среды обычно готовят впрок в колбах большого объема. Перед работой среды разливают в пробирки или чашки Петри в зависимости от назначения. Твердые питательные среды перед разливкой расплавляют. Агар удобнее расплавлять в автоклаве с открытым вентилем или на водяной бане. Желатина легко плавится при нагревании на водяной бане до 25-30єС.

После расплавления среды разливают в посуду необходимого объема, соблюдая стерильность. Для этого горлышко колбы во время разлива проводят через пламя спиртовки, ватную пробку после разлива обжигают.

Во время работы пробку держат между мизинцем и безымянным пальцем правой руки.

После разлива пробирки со средами (в зависимости от характера среды) стерилизуют одним из способов, указанным ниже.

Для получения прямого агара или желатины пробирки ставят в штатив, а для получения окошенных поверхностей сред их кладут наклонно на подставку, но так, чтобы среда не касалась пробок. Те же правила соблюдаются и при разливе жидких сред.

10. Строение и функции цитоплазматической мембраны. Пересев

бактерий из пробирки в пробирку

Элементарная мембрана состоит из бислоя липидов в комплексе с белками (гликопротеины: белки + углеводы, липопротеины: жиры + белки). Среди липидов можно выделить фосфолипиды, холестерин, гликолипиды (углеводы + жиры), липопротеины. Каждая молекула жира имеет полярную гидрофильную головку и неполярный гидрофобный хвост. При этом молекулы ориентированы так, что головки обращены кнаружи и внутрь клетки, а неполярные хвосты – внутрь самой мембраны. Этим достигается избирательная проницаемость для веществ, поступающих в клетку.

Выделяют периферические белки (они расположены только по внутренней или наружной поверхности мембраны), интегральные (они прочно встроены в мембрану, погружены в нее, способны менять свое положение в зависимости от состояния клетки). Функции мембранных белков: рецепторная, структурная (поддерживают форму клетки), ферментативная, адгезивная, антигенная, транспортная.

Схема строения элементарной мембраны жидкостно-мозаич-ная: жиры составляют жидкокристаллический каркас, а белки мозаично встроены в него и могут менять свое положение.

Важнейшая функция: способствует компартментации – подразделению содержимого клетки на отдельные ячейки, отличающиеся деталями химического или ферментного состава. Этим достигается высокая упорядоченность внутреннего содержимого любой эукариотической клетки. Компартментация способствует пространственному разделению процессов, протекающих в клетке. Отдельный компартмент (ячейка) представлен какой-либо мембранной органеллой (например, лизосомой) или ее частью (кристами, отграниченными внутренней мембраной митохондрий).

Другие функции:

1) барьерная (отграничение внутреннего содержимого клетки);

2) структурная (придание определенной формы клеткам в соответствии с выполняемыми функциями);

3) защитная (за счет избирательной проницаемости, рецепции и антигенности мембраны);

4) регуляторная (регуляция избирательной проницаемости для различных веществ (пассивный транспорт без затраты энергии по законам диффузии или осмоса и активный транспорт с затратой энергии путем пиноцитоза, эндо– и экзоцито-за, работы натрий-калиевого насоса, фагоцитоза));

5) адгезивная функция (все клетки связаны между собой посредством специфических контактов (плотных и неплотных));

6) рецепторная (за счет работы периферических белков мембраны). Существуют неспецифические рецепторы, которые воспринимают несколько раздражителей (например, холодовые и тепловые терморецепторы), и специфические, которые воспринимают только один раздражитель (рецепторы световос-принимающей системы глаза);

7) электрогенная (изменение электрического потенциала поверхности клетки за счет перераспределения ионов калия и натрия (мембранный потенциал нервных клеток составляет 90 мВ));

8) антигенная: связана с гликопротеинами и полисахаридами мембраны. На поверхности каждой клетки имеются белковые молекулы, которые специфичны только для данного вида клеток. С их помощью иммунная системы способна различать свои и чужие клетки.

11. Цитоплазма и внутрицитоплазматические включения.

Цитоплазма – это содержимое клетки, окруженное цитоплазматиче- ской мембраной. Фракция цитоплазмы, имеющая гомогенную конси- стенцию и содержащая набор растворимых РНК, ферментных белков, продуктов и субстратов метаболических реакций, получила название цитозоля. Другая часть цитоплазмы представлена структурными эле- ментами: рибосомами, внутрицитоплазматическими включениями, нук- леоидом и мембранными структурами. Рибосомы прокариот имеют константу седиментации 70S. Они обра- зованы двумя субъединицами – 30S и 50S. По величине и некоторым другим особенностям рибосомы бактерий сходны с рибосомами мито- хондрий и хлоропластов. Меньшая субъединица 30S содержит молекулу 16S-рРНК и в большинстве случаев по одной молекуле белков 21 вида. Субъединица 50S состоит из двух типов молекул рРНК (23S и 5S) и око- ло 35 молекул различных белков, представленных, как правило, также одной копией. Бактериальная клетка содержит от 5 до 50 тыс. рибосом, число их тем больше, чем больше скорость роста клетки. Рибосомы служат местом синтеза белка. Синтез белка осуществляет- ся агрегатами, состоящими из рибосом, РНК – информационной (иРНК) и транспортных (тРНК). Такие агрегаты называются полирибосомами или полисомами. Полирибосомы могут быть связаны с мембранными структурами или же находиться свободно в цитоплазме. Различия между рибосомами бактерий (70S) и эукариот (80S) имеют решающее значение для борьбы с инфекционными заболеваниями, так как некоторые антибиотики, действуя бактерицидно или бактериостати- чески, частично или полностью подавляют синтез белка, протекающий на рибосомах 70S-типа, но не затрагивают функционирования рибосом 80S-типа. Внутрицитоплазматические включения подразделяются на актив- но функционирующие структуры и продукты клеточного метаболизма, не выделяющиеся наружу, а откладывающиеся внутри клетки. К первой группе внутриплазматических включений относятся газо- вые вакуоли, или аэросомы, обнаруженные у бактерий, обитающих в во- де. Аэросомы снижают удельную массу бактериальной клетки и благо- даря этому поддерживают ее во взвешенном состоянии в водоеме. Аэро- сома представляет собой скопление газовых пузырьков (везикул), Кото- рые имеют веретенообразную форму. Их оболочка состоит только из белка, т. е. устроена не так, как обычная мембрана. Белковые молекулы ориентированы таким образом, что внутренняя сторона оказывается гид- рофобной, а наружная – гидрофильной. К первой группе включений относятся также хлоросомы зеленых бактерий и фикобилисомы цианобактерий. В этих структурах локализо- ваны пигменты, поглощающие кванты света и передающие энергию воз- буждения на фотореакционные центры, т. е. они принимают непосредст- венное участие в фотосинтезе. Это эллипсовидные образования, окру- женные тонкой белковой оболочкой (толщиной 2,5–3,0 нм), которая со- стоит из отдельных глобул. Карбоксисомы, или полиэдрические тела, содержатся в клетках не- которых автотрофных бактерий. Они имеют форму многогранника диа- метром 90–100 нм, окруженного однослойной белковой оболочкой. В карбоксисомах содержится рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилаза – клю- чевой фермент, катализирующий фиксацию СО2 в цикле Кальвина в процессе фото- и хемосинтеза. Магнитосомы содержатся в водных бактериях, способных ориенти- роваться в магнитном поле и перемещаться в направлении линий маг- нитного поля. В их состав входит 0,4 % железа (по сухому веществу). Магнитосомы располагаются в клетках вблизи мест прикрепления жгу- тиков. Ко второй группе включений (продуктам клеточного метаболизма) относятся запасные вещества – полифосфаты, полисахариды, жиры, се- ра. Эти вещества накапливаются, если в питательной среде находятся со- ответствующие исходные соединения, но вместе с тем рост бактерий ог- раничен или вообще невозможен из-за недостатка каких-то отдельных компонентов питания или же присутствия ингибиторов. Запасные веще- ства содержатся в клетках в осмотически инертной форме, т. е. не рас- творимы в воде. В условиях, благоприятных для роста, когда в этих ве- ществах возникает потребность, они снова включаются в метаболизм. Из полисахаридов в клетках микроорганизмов откладываются глико- ген, крахмал и крахмалоподобное вещество гранулоза. Запасные вещест- ва полисахариды образуются из молекул α-D-глюкозы, которые связаны α-1,4-гликозидными связями. Благодаря такому типу связей полиглюкоз- ные цепи не вытянуты в длину, а закручены винтообразно. Много крах- мала имеют клетки бактерий рода Nеisseria и вида Acetobacter pasteurianus. Гранулоза содержится в большом количестве в клетках бактерий рода Clostridium. Гликоген, или «животный крахмал», синтезируется у бактерий E.coli, у бактерий рода Salmonella, у бацилл, дрожжей и других микроорганизмов. Установлено, что гликоген у бактерий встречается чаще, чем крахмал. Запасные полисахариды используются микроорга- низмами в качестве источников углерода и энергии. Жиры накапливаются в виде гранул и (или) капелек, преломляющих свет по-иному, чем содержимое цитоплазмы, и поэтому хорошо разли- чимы в световом микроскопе. Запасным жироподобным веществом мно- гих бактерий (например, представителей рода Pseudomonas) является по- ли-β-гидроксимасляная кислота. Это полиэфир, растворимый в хлоро- форме и состоящий примерно из 60 остатков β-оксибутирата. Доля этого вещества в сухой биомассе клеток может достигать 80 %. Поли-β-гид- рокси-масляная кислота является хорошим источником углерода и энер- гии. Микроорганизмы могут накапливать также триглицериды (ней- тральные жиры). Особенно много их запасается в клетках дрожжей и других грибов. Кроме того, микобактерии могут содержать до 40 % вос- ков. Полифосфаты откладываются в гранулах, называемых волютиновы- ми или метахроматиновыми зернами. Название «метахроматиновые зерна» обусловлено тем, что они вызывают характерные изменения цвета (метахромазию) некоторых красителей (метиленового синего, толуиди- нового синего). Полифосфаты играют роль фосфатных депо и источни- ков энергии. У многих бактерий, таких как пурпурные и бесцветные серобактерии, зеленые серные бактерии и других, окисляющих сульфид до сульфата, в процессе метаболизма в клетке откладывается молекулярная сера в виде шариков, сильно преломляющих свет. Количество накопляемой серы за- висит от содержания Н2S в окружающей среде. В условиях отсутствия Н2S сера, находящаяся в клетке, окисляется до . Сера служит ис- точником энергии и донором электронов. - 24 SO Специфическими запасными веществами цианобактерий являются цианофитиновые гранулы, состоящие из полипептида, в который вхо- дят аргинин и аспарагиновая кислота в эквимолярных количествах. Ос- тов молекулы полипептида построен из остатков аспарагиновой кислоты, соединенных пептидными связями, а к их β-карбоксильным группам присоединены остатки аргинина. Цианофитиновые гранулы служат ре- зервом азота, который используется цианобактериями при его недостатке в среде.

12. Нуклеоти́ды — фосфорные эфиры нуклеозидов, нуклеозидфосфаты. Свободные нуклеотиды, в частности АТФ, цАМФ, АДФ, играют важную роль в энергетических и информационных внутриклеточных процессах, а также являются составляющими частями нуклеиновых кислот и многих коферментов.

Hуклеотиды являются сложными эфирами нуклеозидов и фосфорных кислот. Нуклеозиды, в свою очередь, являются N-гликозидами, содержащими гетероциклический фрагмент, связанный через атом азота с C-1 атомом остатка сахара.

В природе наиболее распространены нуклеотиды, являющиеся β-N-гликозидами пуринов илипиримидинов и пентоз — D-рибозы или D-2-дезоксирибозы. В зависимости от структуры пентозы различают рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды, которые являются мономерами молекул сложных биологических полимеров (полинуклеотидов) — соответственно РНК или ДНК.

Фосфатный остаток в нуклеотидах обычно образует сложноэфирную связь с 2'-, 3'- или 5'-гидроксильными группами рибонуклеозидов, в случае 2'-дезоксинуклеозидов этерифицируются 3'- или 5'-гидроксильные группы.

Большинство нуклеотидов являются моноэфирами ортофосфорной кислоты, однако известны и диэфиры нуклеотидов, в которых этерифицированы два гидроксильных остатка — например, циклические нуклеотиды циклоаденин- и циклогуанин монофосфаты (цАМФ и цГМФ). Наряду с нуклеотидами — эфирами ортофосфорной кислоты (монофосфатами) в природе также распространены и моно- и диэфиры пирофосфорной кислоты (дифосфаты, например, аденозиндифосфат) и моноэфиры триполифосфорной кислоты (трифосфаты, например, аденозинтрифосфат).

Функции нуклеотидов.

Нуклеотиды выполняют ряд важнейших биологических функций. Прежде всего, они образуют нуклеиновые кислоты. Кроме этого, нуклеотиды входят в состав некоторых ферментов в качестве коферментов, а также участвуют в построении производных соединений, в которых аккумулируется энергия, Необходимая для протекания процессов жизнедеятельности в клетке.

Плазмиды.

Плазмиды — дополнительные факторы наследственности, расположенные в клетках вне хромосом и представляющие собой кольцевые (замкнутые) или линейные молекулы ДНК.

Классификация

Существует несколько систем классификации плазмид, базирующихся на:

• топологии (линейные или кольцевые),

• механизмах репликации (см. выше),

• маркерных генов, содержащихся на плазмидах (например: устойчивость к антибиотикам, гены биодеградации ксенобиотиков, системы рестрикции — модификации, гены синтезабактериоцинов и т. д. — или полному отсутствию оных — криптические плазмиды),

• круге хозяев,

• копийности,

• совместимости,

• конъюгативные (способные к переносу в другие клетки)/неконъюгативные