Кроветворение

Разумеется, причина анемии при ХПН не сводится только к нарушенному воспроизводству эритропоэтина почками, хотя этот фактор и является ведущим в ее развитии. Анемизацию больных с ХПН вызывают и дефицит железа, гастроинтестинальные кровотечения, интоксикация алюминием (следствие гемодиализов с помощью аппарата «искусственная почка»), фиброз костного мозга (вероятно связанный со вторичным гиперпаратиреозом), сниженная продолжительность жизни эритроцитов.

При лечении анемии удается добиться хорошего эффекта, вводя, например, рЭ по 50-100 ЕД/кг массы тела внутривенно, трижды в неделю (после диализа), что обеспечивает прирост гематокрита на 3% в месяц. Этот темп прироста эритроцитарной массы крови может быть заторможен в случае отсутствия одновременного назначения препаратов железа (введение эритропоэтина быстро истощает функциональный резерв железа в организме больного), а также в случаях одновременно имеющейся у больного и интеркуррентной инфекции.

Последняя «стимулирует продукцию медиаторов воспаления», таких как ИЛ-1, опухольнекротирующий фактор или интерферон, снижающих чувствительность костного мозга к эритропоэтину.

6) Лечение анемий, сопровождающих хронические заболевания.

При анемиях, сопровождающих хронические заболевания, такие как ревматоидные артриты, рак, синдром приобретенного иммунного дефицита (СПИД) часто обнаруживают резко сниженный уровень эритропоэтина в крови по сравнению с тем, который должен бы компенсаторно сопровождать дефицит гемоглобина и эритроцитов при анемиях этой глубины. Объясняется это явление тем, что хроническое воспаление сопровождается усиленным высвобождением в кровь ИЛ-1 и опухольнекротизирующего фактора, понижающих продукцию эритропоэтина, снижающих чувствительность костного мозга к этому гормону, что и вызывает эритроидную гипоплазию костного мозга, сниженное количество ретикулоцитов в крови. Одновременно ИЛ-1 (и опухольнекротизирующий фактор?) индуцируют высвобождение связывающих железо плазмы белков, например, таких как лактоферрин из активированных при воспалении нейтрофилов. В свою очередь лактоферин и другие белки стимулируют накопление железа в системе фагоцитирующих мононуклеаров, формируя низкий уровень железа в сыворотке крови, уровень сывороточного ферритина оказывается увеличенным. Использование костным мозгом этого возросшего тканевого запаса железа при низком уровне эритропоэтина в крови оказывается заторможенным.

Действительно, введение рекомбинантного эритропоэтина больным с анемией, сопровождавшей ревматоидный артрит, больным со СПИДом, имевшим концентрацию эритропоэтина в крови ниже 500 мЕД/мл и лечившихся одновременно зидовадином, а также анемизированным больным раком отчетливо улучшало показатели эритрона и общее состояние больных. Эффективными лечебными дозами эритропоэтина при анемиях, сопровождающих СПИД, оказались 100-200 Ед/кг массы, вводимые трижды в неделю, и 100-150 Ед/кг массы трижды в неделю в случаях анемий, сопровождающих злокачественное опухолевое заболевание. Лечение анемий, сопровождающих ревматоидный артрит потребовало больших доз эритропоэтина. Это предполагает, что чувствительность к эритропоэтину кроветворных клеток при этой форме заболевания оказывается ниже, чем, например, при анемии, сопровождающей хроническую почечную недостаточность.

Рекомбинантные КСФ-Г, КСФ-ГМ и ИЛ-3.

Рекомбинантные КСФ-Г и КСФ-ГМ были получены на основе бактериальной клетке (Еscherichia coli) или в клонирования участков ДНК человека, ответственных за синтез этих цитокинов в клетках млекопитающих (овариальная клетка китайского хомячка).

Успешным оказалось применение рекомбинантных форм этих гормонов – рКСФ-Г и рКСФ-ГМ с целью стимуляции кроветворения, угнетенного химиотерапией, применяющейся при лечении рака (например, рака легкого с применением циклофосфамида), лейкемии и вызывающей гранулоцитопению (нейтропению), резко увеличивающую риск вирусной и микробной инфекции. Например, риск развития инфекции достигает 100% у больных, если вследствие примененной миелодепрессивной химиотерапии количество гранулоцитов снижается в крови ниже 0,1х10⁹ /л. Показателем резко увеличивающегося риска возникновения инфекции оказывается снижение нейтрофилов до 500-100/мм³ у больных во время миелоапластических воздействий, предшествующих трансплантации костного мозга). Применение одного рКСФ-Г или в сочетании с рКСФ-ГМ уменьшало продолжительность и глубину развивающейся нейтропении. С повышением уровня нейтрофилов в крови больных уменьшался и риск развития инфекции.

Введение рКСФ-ГМ и рКСФ-Г больным не только увеличивало количество нейтрофильных лейкоцитов в крови, но и вызывало «сдвиг влево» в их формуле, увеличивало в периферической крови содержание КОК всех линий кроветворения, в костном мозге увеличивалось соотношение лейко/эритро, возрастало количество про- и миелоцитов. Нейтрофилы периферической крови увеличивали цитотоксическую активность, а у моноцитов стимулировалась продукция опухолевонекротизирующего фактора и интерферона. В сыворотке крови после введения этих КСФ уменьшалось содержание холестерина, увеличивалась концентрация лактатдегидрогеназы и щелочной фосфатазы.

Эти свойства рКСФ-Г и рКСФ-ГМ обусловили их применение и лечебные эффекты при СПИД, апластической анемии, миелодиспластическом синдроме, характеризующихся сниженным уровнем нейтрофилов в крови и соответственно пониженной устойчивостью к инфекции.

Применение КСФ-миелоидных – рКСФ-ГМ и рКСФ-Г оказалось эффективным при циклической нейтропении (циклическая нейтропения характеризуется циклическими 14-28-дневными нарушениями воспроизводства тромбоцитов, миелоидных и эритроидных клеточных линий. Для периода же нейтропении оказываются характерными инфекции, лихорадка, поражения слизистых. Лечение больных введением КСФ-Г повышает содержание нейтрофилов в крови, уменьшает частоту развития инфекции, воспаления слизистых и лихорадки).

Хороший эффект вызывает введение КСФ-Г детям с врожденной нейтропенией: введение цитокина понижало риск развития инфекций, улучшало рост и физическое развитие детей, качество их жизни.

При терапии опухолей положительные лечебные эффекты были получены при сочетанном применении рекомбинантного некротизирующего опухоль фактора и миелоидных КСФ. Способность рИЛ-3, рКСФ-Г, рКСФ-ГМ усиливать пролиферацию и дифференциацию КОК обусловило применение этих рекомбинантных цитокинов при трансплантациях костного мозга, начиная с 5 дня после инфузии СКК больному, подвергнутому миелапластическим воздействиям.

Вводят КСФ преимущественно внутривенно, поскольку полупериод их жизни короток. Лучшие эффекты дают комбинации КСФ (выше мы указывали на их перекрестные эффекты). Установлено также, что большие дозы вводимых КСФ могут вызывать осложнения у больных. Так, КСФ-ГМ вызывал болезненность мышц, суставов, лихорадку, усталость, потерю аппетита, что объясняется его способностью стимулировать секрецию интерферона и опухольнекротизирующего фактора.

Введение КСФ-ГМ вызывает эозинофилию, в легких больных могут формироваться эозинофильные инфильтраты. Однако, указанные осложнения могут быть предотвращены назначением КСФ-ГМ в дозе 2-30 mrр/день/кг массы тела, не оказывающих токсического эффекта.

КСФ-Г, вводимый в больших дозах детям вызывал увеличение селезенки, связанное со стимуляцией экстрамедуллярного миелопоэза. Минимальную токсичность он оказывает в дозе 30-60 mгр/день/ кг массы тела.

Новые знания о роли КСФ в регуляции гемопоэза формируют и новые подходы к пониманию патогенеза тяжелых болезней крови у человека. Например, оказалось, что линия лейкозных клеток человека (промиелоцитарная лейкемическая линия НL-60) при добавлении КСФ-Г подвергается нормальной дифференциации до зрелых форм, способность к самообновлению лейкозных КОК терялась. Напротив, некоторые другие линии лейкозных клеток резко повышают переживание и пролиферацию их КОК при добавлении КСФ и, следовательно, добавление КСФ лишь усилит развитие данного опухолевого клона. Третьи же обнаруживают независимый от КСФ рост в культуре, поскольку они экспрессируют гены для воспроизводства факторов, требуемых для их роста. В этом случае рост лейкозных клеток удается подавить применяя лечение антителами, нейтрализующими фактор роста. Следовательно, изучение ин витро свойств КОК больных лейкозами позволяет наметить индивидуальные подходы к их лечению.

Роль стромы гемопоэтических органов в регуляции кроветворения.

Важную роль в регуляции кроветворения играет строма костного мозга. К ней относят макрофаги, структуры эндоста – соединительнотканной оболочки, выстилающей костномозговую полость, костномозговые синусоиды, жировые клетки, соединительную ткань и нервные окончания. Эти структуры формируют «гемопоэтическое индуцирующее микроокружение» (ГИМ), необходимое для пролиферации, дифференциации и фиксации СКК в костном мозге, размножения и созревания миелоидных клеток. Так, механическое повреждение структур стромы костномозговых синусоидов или эндоста в эксперименте тормозит регенерацию костного мозга. С эндостом, покрывающим поверхность костных трабекул, взаимодействуют делящиеся КОК. Более же зрелые клетки располагаются у костномозговых синусоидов. Гемопоэтический эффект стромы достигается созданием «ниш» микроокружения, обеспечивающих прямой межклеточный контакт и интенсивный молекулярный обмен стромы с гемопоэтическими клетками. Элементы стромы формируют ГИМ, продуцируя ростковые факторы, экстрацеллюлярный матрикс, содержащий фибронектин, ламинин, коллаген, гемонектин, протеогликаны и глюкозаминогликаны (ГАГ).

СКК, КОК-ГММЭ и малодифференцированные бипотенциальные клетки выходят из костного мозга в кровь и циркулируют в ней. Это обеспечивает постоянный обмен клетками между анатомически разделенными участками кроветворной ткани. Однако, пролиферировать и дифференцироваться эти клетки способны лишь в ткани костного мозга и необходимые для этого условия создает ГИМ, его экстрацеллюлярный матрикс (ЭЦМ). В состав ЭЦМ входят три типа коллагена: I и III типы секретируются фибробластами, IV тип – белок основной мембраны – эндотелиальными клетками. Угнетение синтеза коллагена в костном мозге уменьшает и продукцию СКК и КОК. Фибронектин – гетеродимерный гликопротеин, с дисульфидными связями около карбоксильного окончания, МВ 450 кд. Его молекула содержит несколько функциональных участков (доменов), опосредующих приклеивание клеток к коллагену и ламинину.

Ламинин – гликопротеин, состоящий из трех цепей, уложенных в форме перекрещивающейся третичной структуры и стабилизированной дисульфидными мостиками (М.В. 900 кд). Ламинин является частью базальной мембраны, секретируемой эндотелиальными клетками. Гемонектин – белок, М.В. 60 кд., обнаруживается только в костном мозге и, как предполагается, преимущественно связывает незрелые гранулоциты, регулируя их освобождение из костного мозга по мере созревания. Протеогликаны – это высокомолекулярные соединения, в которых сульфатированные глюкозаминогликаны соединены с белковым ядром. Все компоненты ЭЦМ взаимодействуют на поверхности гемопоэтических клеток с особыми рецепторами, получившими название интегринов.

Адгезивный гликопротеин фибронектин выполняет «якорную» функцию в отношении КОК-ГММЭ и эритроидных предшественников, которые приклеиваются к нему через рецептор-интегрин, «узнающий» аргинил-глицил-аспарил-сериновый локус фибронектинового домена. Эти клетки-предшественницы после узнавания и связывания фибронектина усиливают пролиферацию и дифференцирование. КОК миелоидные не приклеиваются к фибронектину и не отвечают на его активность росткового фактора. Это позволяет предположить, что потеря чувствительности к фибронектину у КОК включает программу, ведущую к развитию миелоидных предшественников, а сохранение чувствительности к фибронектину есть характерная черта развития столовых клеток по эритроидному пути. Действительно, особые микроворсинки ретикулярных и эндотелиальных клеток стромы фиксируют СКК и КОК-ГМ. Так, при использовании долговременных жидких культур костного мозга мышей показано, что на поверхности клеток стромального слоя культуры начинают формироваться изолированные ворсинки. Ин виво двойниками этих клеток являются ретикулярные клетки, а также эндотелиальные клетки костномозгового синуса, имеющие аналогичные ворсинки. Ворсинки обнаруживают аксонемальную структуру, но утратившую микротрубочки. Ворсинки имеют 2,5 мкм в длину и 0,35 мкм в диаметре. Эти ворсинки могут выполнять функцию избирательной фиксации СКК и КОК гранулоцитарно-моноцитарных. Предполагается, что в основе этих взаимодействий лежат лектин-углеводные связи. Рецептивные свойства ворсинок обнаруживают галактозильные и манозильные особенности. Эта гипотеза подтверждается угнетением удержания стромой костного мозга СКК и КОК-Г после введения животным синтетических неогликопротеидов, блокирующих лектин-углеводные связи стромальных клеток.

Строма костного мозга продуцирует особый фактор стволовой клетки (см.выше), который не вызывает пролиферации КОК, но резко усиливает пролиферативный эффект КСФ на эти клетки.

Содержание ГАГ (гепарансульфата, хондроитинсульфата, гиалуроновой кислоты и др.) в зкстрацеллюлярном пространстве костного мозга намного выше, чем в миелокариоцитах. Оно увеличивается в 2-4 раза при гранулоцитарной и эритроидной гиперплазиях и уменьшается при торможении эритропоэза. Концентрация ГАГ в органах кроветворения зависит от особенностей гемодинамики, кислородного режима, плотности клеток в ткани, изменяется при стрессе. Так, активация эритропоэза (циркуляторной, гемической или гипоксической гипоксией) сочетается с увеличением в нем концентрации нейтральных глюкозаминогликанов, а гранулоцитопоэза – кислых ГАГ-ов (гепарансульфата, дерматансульфата, гиалуроновой кислоты и др.). Эффект ГАГ реализуется через увеличение проницаемости мембран гемопоэтических клеток для кальция и активацию в них системы циклических нуклеотидов с увеличением концентрации цAMФ. Таким образом, ГАГ способствуют формированию вторичных посредников, обеспечивающих быстрое распространение сигнала от рецептора гемопоэтической клетки к ее геному в ходе действия КСФ на КОК. Одной из важнейших функций ЭЦМ является создание высокой концентрации ростковых факторов в микроокружении КОК. Образующиеся комплексы «ГАГ-цитокины» создают высокие концентрации последних в микроокружении клеток-предшественниц. Эти комплексы легко диссоциируют в присутствии специфических рецепторов факторов роста клеток – предшественниц. Так, некоторые формы фактора роста фибробластов, КСФ-ГМ и ИЛ-3 оказываются представленными клеткам-мишеням в большей концентрации после предварительной связи с протеогликанами ЭЦМ. Взаимодействие ИЛ-3 с гепарансульфатом-протеогликаном резко увеличивает его адгезию к КОК-ГММЭ и БОЕ-Э. Гепарансульфат-протеогликан, взаимодействуя с c^-kit лигандом, в 2 раза увеличивает также приклеивание КОК-ГММЭ и КОК-ГМ к строме костного мозга. Все же способность связывать некоторые цитокины – ИЛ-7, основной фактор роста фибробластов и интерферон-g оказывается выше у гепарина, чем у гепарансульфата. Комплексы, образуемые цитокинами и комплексами ЭЦМ, например, глюкозаминогликанов с фактором роста фибробластов, обладают большим сродством (аффинитетом) к специфическим рецепторам, чем цитокины сами по себе.

Ныне рецепторы на клеточной поверхности для белков ЭЦМ охарактеризованы для большинства клеток костного мозга, лимфоцитов. Эти рецепторы получили название интегринов и выделены в особую «суперсемью», включающую, в частности, белки, опосредующие связывание клеток с ЭЦМ. Каждый из этих рецепторов состоит из нековалентной ассоциации a– и b₁ цепей («суперсемья» VLA).

При этом a цепь определяет специфичность связываемого лиганда. Например, рецептор фибронектина гемопоэтических клеток представлен ассоциацией a₅ b₁ (интегрин VLA-5) и взаимодействует лишь с ним. Другие рецепторы могут иметь множественные матриксные лиганды, например, a₃ и b₁ связывает фибронектин, ламинин, коллаген. Взаимодействие интегринов с их лигандами изменяет образование вторичных мессенжеров в клетках крови и КОК. Например, взаимодействие лимфоцитарных интегринов СДПа/СД18 с перекрестно реагирующими с ними антителами вызывает увеличение в клетках Са²⁺ и инозитолтрифосфата. С другой стороны, интегрины способны взаимодействовать с компонентами матрикса синергично рецепторам цитокинов, что также усиливает изменения на уровне вторичных месенжеров в КОК.

Взаимодействие КОК с ЭЦМ изменяет параметры цитоскелета этих клеток. Изменения же последнего влияют на количество рецепторов на плазматической мембране, секрецию цитокинов, функцию рибосом и транскрипцию генов этих клеток. Клеточно-матриксные взаимодействия могут производить изменения изоформы белков мембраны клеток, например, белка 4.1 эритроидной мембраны дифференцирующейся эритроидной клетки и, следовательно, могут регулировать формирование ансамбля последовательностей белков мембраны во время эритроидной дифференциации.

Понимание гемопоэтических эффектов стромы костного мозга повысило интерес гематологов и к прижизненному исследованию ее взаимоотношений с гемопоэтическими клетками у человека и животных. Достигается это использованием специальных приемов (обзор: Ю.М.Захаров и соавт., 1994) не разрушающих данные межклеточные контакты, что обычно происходит при аспирации костного мозга (при стернальной пункции). Еще в 1956r. французский гематолог М.Бессис показал, что в костном мозге человека и животных эритропоэз от проэритробласта до ретикулоцита протекает в ассоциациях этих клеток с макрофагами костного мозга, получивших название эритробластических островков (см. эритропоэз). В жидкости межклеточной щели ЭО концентрация эритропоэтина, других биологически активных веществ во много раз превосходит концентрацию гормона в аналогичном объеме плазмы.

Более крупные, мультиклеточные ассоциации гемопоэтических и стромальных клеток (мультиклеточные сфероиды, до 100-500 мкм в диаметре), получившие название гематона, выделяют из аспиратов костного мозга в градиенте плотности с помощью фикола-гапака и дифференциального центрифугирования. Гематон организован в трехпроекционную сеть, состоящую из центрального преадипоцита/адипоцита, мезенхимальных и ретикулярных клеток, резидентных макрофагов, тесно ассоциирующих с различными КОК и их потомками. Гематон оказывается в 2-3 раза богаче КОК по сравнению с цельным костным мозгом. В гематоне компоненты ЭЦМ, такие как гепарансульфат, гемонектин, а также антигены НLA-ДR и интегрины на поверхности клеток обеспечивают тесные мембранные контакты между стромальными и гемопоэтическими клетками-предшественницами. Компоненты ЭЦМ резко увеличивают концентрацию КСФ, других биологически активных веществ, например, жирорастворимых гормонов и витаминов вблизи КОК и способствуют их поступлению в эти клетки. Так, в гематоне концентрация 1,25-дигидрооксивитамина Д₃ оказывается в 100-1000 раз выше, чем в плазменной фракции костного мозга.

Предполагается, что гематон представляет фундаментальную единицу первичного гемопоэза, ответственную за органогенез, гомеостазис и компенсаторную регенерацию костного мозга. Заслуживает внимания, что если гематоны постоянно выделяются из костного мозга здоровых людей, то при заболевании крови – миелодиспластическом синдроме, острой нелимфоцитарной лейкемии, хронической лейкемии гематоны не выделяются или выделяются а весьма малых количествах. С другой стороны, установлено, что в костном мозге генеративная гемопоэтическая зона, т.е. зона наиболее богатая образующимися КОК, интимно связана с эндостом, покрывающим поверхность костных трабекул. Из этой зоны выходят морфологически распознаваемые гемопоэтические клетки, они более богата молодыми эритробластическими островками.

ЛИТЕРАТУРА

1. Чертков И. Л., Гуревич О. А. Стволовая кроветворная клетка. М.: Медицина, 1984.

2. Чертков И. Л., Дерюгина Е. И., Абрахам Н. Г., Левир Р. Д. Стволовая кроветворная клетка: дифференцировочный и пролиферативный потенциал //Успехи соврем. биол. 1991. Т. 111, № 6. С. 905-922.

3. Чертков И. Л., Дризе Н. И. Клональное кроветворение у мышей: изучение с помощью генетически маркированных стволовых клеток //Пробл. гематол. перелив. крови. 1996. № 2. С. 19-29.

4. Drize N. J., Keller J. R., Chertkov J. L. Local clonal analysis of the hematopoietic system shows that multiple small short-living clones maintain life-long hematopoiesis in reconstituted mice //Blood. 1996. V. 88, № 8. P. 2927- 2938.

5. Drize N. J., Chertkov J. L., Sadovnikova E. Yu., Tiessen S., Zander A. R. Long-term maintenance of hematopoiesis in irradiated mice by retrovirally transduced peripheral blood stem cells //Blood. 1997. V. 89, №5.