2.5 Особенности активации протромбина.

Активация протромбина в тромбин – ключевая реакция системы свертывания крови, имеет ряд особенностей, отличающих этот процесс от активации проферментов других сериновых протеиназ.

Превращение протромбина в тромбин сопровождается отщеплением половины молекулы, тогда как активация других факторов свертывания ведет к освобождению только активационных пептидов. При образовании тромбина происходят значительные изменения пространственной структуры молекулы. В отличие от других факторов протромбинового комплекса, которые после превращения в фермент остаются связанными с поверхностью мембраны клетки через Гла-домен, тромбин не имеет в структуре этого домена и освобождается после активации. В структуре тромбина формируется новый центр связывания с рецепторами мембраны клетки.

В протромбине выделяют три домена: N-концевой фрагмент 1, фрагмент 2 и каталитический домен- претромбина 2, предшественник тромбина( рис ). Фрагмент 1 протромбина отвечает за связывание ионов кальция и фосфолипидов. Фрагмент 2 обеспечивает связывание профермента с кофактором фактора Xa - фактором Va .

Ограниченный протеолиз протромбина протромбиназой осуществляется в несколько стадий (Рис 6).

На первой стадии фактор Xa протромбиназы расщепляет одну пептидную связь Arg320-Ile321 в структуре каталитического домена протромбина - претромбине 2. 12Образуется первый промежуточный продукт- мейзотромбин, в котором две части молекулы протромбина соединены дисульфидной связью. Мейзотромбин остается связанным с поверхностью и обладает очень низкой ферментативной активностью, достаточной для активации протеина С. Однако мейзотромбин не проявляет прокоагулянтную активность тромбина и не инактивируется антитромбином III. Вместе с тем мейзотромбин проявляет вазоконстрикторную активность.

На следующей стадии фактор Xa в гидролизует еще одну связь ( Arg271-Tre272) в структуре мейзотромбина между фрагментом 2 и претромбином 2, отщепляя фрагмент 1 + 2 и освобождая тромбин.

Тромбин состоит из двух цепей ( А-легкой и В –тяжелой) соединенных дисульфидной связью. В структуре тяжелой цепи локализован каталитический центр и участки связывания субстрата.

В структуре протромбина тромбин может специфически расщеплять связь Arg155 – Ser 156, освобождая фрагменты 1 и 2 протромбина. Однако эта реакция требует достаточно высоких концентраций фермента, которые не возникают при физиологической активации протромбина в условиях in vivo.

Тромбин- первый фермент в каскаде свертывания, который освобождается в окружающую среду. В структурах всех других ферментов - активных форм факторов свертывания крови, сохраняются участки связывания с поверхностью.

3. Функции протеиназ системы свертывания крови

3.1 Тромбин: структура и свойства.

Тромбин-протеолитический фермент, относится, как и все ферменты свертывающей системы крови (кроме фактора XIIIa), к группе пептид-гидролаз, подгруппе протеиназ, классу сериновых протеиназ семейства трипсина.

Тромбин – гликопротеид(40kDa), содержащий ок 5% углеводов. Молекула тромбина состоит из двух полипептидных цепей( А и Б), соединенных дисульфидной связью. А-цепь тромбина быка содержит 49 ао, а у тромбина человека она укорочена на 13 ао с N-конца молекулы. Б-цепи обоих тромбинов почти идентичны и состоят из 259 остатков.Структура Б-цепи тромбина поддерживется тремя дисульфидными связями. Выявлена высокая степень гомологии аминокислотной последовательности тромбина и родственных протиназ – трипсина и химотрипсина в тех частях молекулы, где локализованы аминокислоты триады каталитического участка активного центра – Гис 43, Асп 99 и Сер 205, образующие систему переноса заряда. Активность тромбина, как и других сериновых протеиназ, подавляется диизопропилфторфосфатом (ДФФ) и тозиллизилхлорметилкетоном, избирательно блокирующими серин и гистидин активного центра. Высокоспецифическим экзогенным ингибитором тромбина является гирудин (7kDa)– полипептид из секрета слюнных желез медицинской пиявки( Hirudo medicinalis), который в пикомолярной концентрации блокирует протеолитическую активность фермента, связываясь с молекулой тромбина вне каталитического участка активного центра в области экзосайта центра узнавания специфических субстратов и рецепторов : анионсвязывающего экзосайта 1. Природным ингибитором тромбина является антитромбин III( cм глава 4).

Тромбин и трипсин имеют одинаковую первичную специфичность: они расщепляют эфирные,амидные и пептидные связи основных аминокислот– аргинина и лизина. Но тромбину в отличие от трипсина свойственна избирательность при отборе субстратов. Он не гидролизует обычные субстраты протеиназ такие, как казеин, гемоглобин, альбумин, а проявляет специфичность высшего порядка в выборе субстратов и гидролизуемых связей. В отличие от трипсина тромбин-узкоспецифичная протеиназа,тк расщепляет только одну или несколько связей в своих субстратах.

Высокая специфичность тромбина впервые продемонстрирована на примере его основного субстрата фибриногена, у которого тромбин гидролизует только четыре аргинил(Арг)-глициновые(Гли) связи из 387 доступных трипсину.Катализ образования фибриновых сгустков -наиболее известная и лучше других изученная биологическая функция тромбина.