2. Cтруктурные особенности факторов свертывания крови.

В соответствии со структурными особенностями факторы свертывания и белки крови, участвующие в образовании основного фермента системы свертывания- тромбина, можно разделить на несколько групп.

1) Факторы протромбинового комплекса (Таблица 4.Рис 1). К ним относят протромбин (фактор II), факторы свертывания крови VII(проконвертин), IX(фактор Кристмаса, антигемофильный фактор В), X (фактор Стюарта) и белки антикоагулянтной системы протеина С- протеин С, протеин S и протеин Z . Характерной особенностью этой группы служит наличие на амино(N)конце каждого белка специфической последовательности, осуществляющей связывание молекулы с фосфолипидами поверхности активированной клетки, преимущественно тромбоцита. На карбокси(C)конце всех факторов протромбинового комплекса, кроме протеинов S и Z, находится каталитический ( или протеазный) домен, расщепление в структуре которого одной или двух пептидных связей ведет к образованию фермента-протеиназы. Протеины S и Z служат кофакторами и не активируются в ферменты. Протеин S - кофактор активированного протеина С, а протеин Z – кофактор ингибитора фактора Xa, который именуют - ингибитором, зависимым от протеина Z(IPZ).

2).Факторы контактной фазы свертывания( Рис1). К ним относят проферменты-факторы XII ( фактор Хагемана) и XI свертывания крови и прекалликреин (Таблица 4). Характерной особенностью белков этой группы является способность связываться с отрицательно заряженной поверхностью и образовывать ферменты-протеиназы.

3)Кофакторы: факторы свертывания V(проакцелерин),VIII (антигемофильный фактор А, VIII:С) и высокомолекулярный кининоген (ВМК), которые характеризуются тем, что имеют высокий молекулярный вес, мультидоменную структуру и не служат предшественниками протеиназ, а выполняют роль высокомолекулярной подложки для проферментов системы свертывания крови.

Разделение на группы достаточно условно, поскольку некоторые факторы могут быть отнесены к двум группам, например факторы протромбинового комплекса протеин S и протеин Z служат кофакторами протеина С и ингибитора фактора Xa – ZPI, соответствено. Фактором I свертывания крови является фибриноген – основной субстрат тромбина.

Факторы протромбинового комплекса

Структурное подобие факторов протромбинового комплекса, свидетельствует в пользу дупликации гена предшественника, его модификации в течение эволюции. Каталитические домены свертывающих протеиназ относятся к трипсиноподобным сериновым протеиназам, каталитический участок активного центра которых формируется триадой аминокислот, соответствующих Гис57, Сер195, Асп102 химотрипсина. Ферменты находятся в крови в форме проферментов, которые превращаются в активные формы вследствие протеолиза одной или двух пептидных связей. Синтез проферментов протромбинового комплекса происходит в печени и зависит от витамина К, который служит коферментом фермента - γ-глутамилкарбоксилазы. Витамин К переходит в активную форму гидрохинона после восстановления из эпоксида под действием фермента печени – редуктазы ( РИС2). Витамин К - кофермент в реакциях γ - карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты в предшественнике протромбина и в некоторых других неактивных формах факторов свертывания крови с образованием остатков γ-карбоксиглутаминовой кислоты. В результате соответствующие участки молекул белков-предшественников приобретают способность связывать Са⁺ и подвергаться активации с образованием активных факторов свертывания крови, в частности протромбина. Витамин К участвует также в γ-карбоксилировании остатков глутаминовой кислоты в некоторых Ca-связывающих белках, в частности в остекальцине.

Кумариновые препараты (например, дикумарин, варфарин и др.) блокируют действие редуктазы и синтез протромбина. Фермент печени карбоксилаза в присутствии востановленной формы витамина К катализирует карбоксилирование 10 или 12 остатков глутаминовой кислоты на N-концевом участке молекул факторов протромбинового комплекса. В результате реакции образуются так называемый Гла-домен на аминоконце факторов, содержащий остатки -карбоксиглутаминовой кислоты (-кГлу). Два или три остатка -кГлу связывают один ион кальция, вызывая конформационные изменения в молекуле и экспонирование участков связывания мембран клеток. Кроме того, эти остатки прямо связываются с мембраной через кальциевые мостики. Связывание кальция крови хелаторами предотвращает ее свертывание. В присутствии антагонистов витамина К - дикумарина, варфарина и др., синтезируются аномальные белки протромбинового комплекса, которые не связываются с фосфолипидами мембраны и не активируются. На основе дикумарина создано много непрямых антикоагулянтов.

Многие белки вовлекаемые в гемостаз имеют “крингл”-домены, названные С.Магнуссоном (Дания), который расшифровал структуру этих доменов в молекуле протромбина(Рис 1). Крингл-домены содержат 80-85 аминокислотных остатков, образующих благодаря трем дисульфидным мостикам характерные триплетные петли (похожие по форме на шведские бублики - кринглы). Крингл-домены ответствечают за связывание профермента с поверхностью.

Другой домен, структурно подобный доменам эпидермального фактора роста (EGF), обнаружен у многих факторов свертывания(VII,IX,X,XII) и отвечает за связывание с поверхностью клеток.

В структуре протромбина и факторов VII,IX и X содержится пятичленная последовательность ароматических аминокислот Phe-Trp-X-X-Tyr, экспонированных наружу молекулы, которые создают гидрофобный домен, взаимодействующий с клеточными мембранами.

Факторы контактной фазы свертывания

К факторам контактной фазы свертывания относят фактор XII ( Хагемана), фактор XI, и прекалликреин, поскольку для активации этих проферментов в условиях in vitro требуется контакт с отрицательно заряженной поверхностью, на которой эти белки легко сорбируются. Для активации фактора XI и прекалликреина необходим также белковый кофактор – высокомолекулярный кининоген (ВМК).

Фактор XII – гликопротеин (Мr 78кDa), содержащий 6 доменов (Рис 1). На аминоконце молекулы фактора XII локализованы блоки типа II и типа I, структурно подобные доменам фибронектина ( FN-2 и FN-1), связывающим коллаген и фибрин, соответственно. Между этими блоками расположен домен 2, подобный домену эпидермального фактора роста(EGF).За доменом3 типа I фибронектина (FN-1) следует еще один домен EGF и далее один крингл домен(5 домен), который через связывающий участок соединен с каталитическим ( протеазным) шестым доменом, локализованным на С-конце молекулы.

Фактор XI циркулирует в кровотоке в нековалентном комплексе с высокомолекулярным кининогеном (ВМК). Молекула фактора XI – крупный гомодимер( Мr 143кDa), состоит из двух идентичных полипептидных цепей, соединенных дисульфидными связями (Рис ). В структуре каждой из двух цепей фактора XI обнаружены четыре домена повторяющихся последовательностей с высокой степенью гомологии и каталитический домен на С-конце молекулы. Триада каталитического центра фактора XI образована остатками His 413, Asp462 и Ser557. Все повторяющиеся домены по структуре подобны яблоку (apple- домены), содержат 6 высококонсервативных остатков цистеина, образующих три дисульфидные связи, и имеют высокую степень гомологии соответствующим доменам прекалликреина. Аpple - домены повторяющихся последовательностей отвечают за связывание фактора XI с кофактором - высокомолекулярным кининогеном.

Высокомолекулярный кининоген (ВМК )- крупная молекула(120кDa), состоит из 6 доменов.На N –конце ВМК в домене1 локализован сайт связывания ионов кальция,в доменах2 и3 обнаружен консервативный мотив QVVAG, ответственный за ингибиторную активность ВМК в отношении цистеиновых протеиназ(кальпаина,катепсинов В и H, папаина). В доменах 3 и 5 локализованы сайты связывания с поверхностью клеток( тромбоцитов,эндотелиальных клеток,нейтрофилов), присутствием которых могут быть обусловлены антиадгезивные свойства ВМК.В домене 5 обнаружен участок, содержащий положительно заряженные остатки Lys,His, а также Gly , который несет ответственность за связывание с отрицательно заряженной поверхностью активированных клеток и формирование ансамбля факторов контактной фазы свертывания. В домене 4 локализована структура брадикинина, который выщепляется из ВМК калликреином и подобными ему ферментами. С-концевой домен 6 имеет протяженные участки связывания фактора XI и прекалликреина.

Кофакторы: факторы свертывания

Кофакторы - факторы V и VIII свертывания крови, крупные молекулы (Таблица 4, Рис 3), имеющие значительную гомологию структур. Оба белка содержат три разных типа доменов в последовательности А1-А2-В-А3-С1-С2. Три А домена имеют высокую степень гомологии доменам церулоплазмина. Два подобных друг другу С домена ( F5/8-C –домены) гомологичны доменам дискоидина. Большой центральный B домен называют связывающей областью, поскольку он локализован между тяжелой цепью, состоящей из двух А доменов и легкой цепью, образуемой одним А доменом и двумя С доменами. Существенные различия между факторами V и VIII обнаружены в структуре связывающей области, которая отщепляется при активации факторов и функционирует как пептид активации.

Тромбин расщепляет фактор V по остаткам Arg709, Arg1018 и Arg1545. Активированная тромбином форма фактора V- фактор Vа, гетеродимер (А1-А2/А3-С1-С2), состоит из тяжелой и легкой цепей, стабилизированных ионами Са. Фактор Vа – кофактор фактора Xa, активатора протромбина. Участки связывания протромбина, фактора Xa и протеина S, кофактора активированного протеина С (АРС), локализованы в тяжелой цепи фактора Va, а за связывание фосфолипидов мембраны клеток и АРС отвечают участки легкой цепи.

Фактор VIII секретируется как гетеродимер вследствие расщепления по крайней мере двух связей в В домене. В циркуляции белок стабилизирован фон Виллебранда фактором и имеет время полужизни около 10 часов. Тромбин гидролизует фактор VIII по остаткам Arg372, Arg740 и Arg1689, выщепляя В домен и расщепляя один из высокоаффинных участков связывания фон Виллебранда фактора. Фактор VIII превращается в фактор VIIIа, гетеротример (А1/А2/А3-С1-С2) , субъединицы которого стабилизированы ионами Са. Фактор VIIIа – эффективный кофактор фактора IXa, активатора фактора X. Инактивация фактор VIIIа происходит вследствие диссоциации двух А доменов тяжелой цепи или специфического расщепления связи между А1 и А2 доменами активированным протеином С. Фон Виллебранда фактор повышает стабильность фактора VIII и защищает его от инактивации АРС. Контроль активации фактора X является критическим событием гемостаза и тромбоза.

Субстрат свертывания - фибриноген

Фибриноген, составляющий структурную основу тромба, состоит из трех пар неидентичных полипептидных цепей, обозначаемых как Аa, Вb и g(Рис ). Молекула фибриногена состоит из трех модулей (доменов), выявленных электронной микроскопией. Аминоконцевые части всех трех цепей образуют центральную область взаимодействия двух субъединиц молекулы фибриногена, ковалентно связанных между собой тремя дисульфидными мостиками, так называемый, Е домен. Карбоксиконцевые (С) участки b и g цепей образуют D домены фибриногена.

Фактор XIII - фибринстабилизирующий фактор, существует в двух формах –плазменный и тромбоцитарный. Плазменный фактор XIII- тетрамер , состоящий из двух пар цепей ( и ), а тромбоцитарный содержит только  - цепи.