Радионуклидный метод.
В основе метода лежит регистрация изотопов углерода С13, С14 в выдыхаемом воздухе. Проба проводится натощак. Перед приемом мочевины, с мечеными углеродами, у пациента отбирают 2 пробы с интервалом в 1 минуту. Затем пациент принимает внутрь лёгкий пробный завтрак и тестируемый субстрат, содержащий мочевину, меченную С13 , С14. В течение 1 часа с интервалом 15 минут собирают 4 пробы выдыхаемого воздуха в специальную пробирку-контейнер. Концентрацию С13, С14 в полученных образцах, исследуют на масс-спектрометре. Полученные данные выражают в процентах и соотносят со степенью инфицированности.
Легкая степень – менее 3,5 % С13 или С14 в выдыхаемом воздухе
Средняя степень – 3,5-6,4% С13 или С14 в выдыхаемом воздухе
Тяжелая степень – 6,5% - 9,4% С13 или С14 в выдыхаемом воздухе
Крайне тяжелая степень – более 9,5% С13 или С14 в выдыхаемом воздухе
Нормальным содержанием С13 или С14 в выдыхаемом воздухе считается не более 1% от общего содержания СО2 .
Разновидностью радиоизотопного метода диагностики Нр является определение изотопа N15 в моче обследуемого. Метод неинвазивный и с высокой чувствительностью и специфичностью, привлекает внимание как перспективный для использования в педиатрии.
Серологический метод.
Иммунологическая диагностика Helicobacter pylori основывается на определении антител разных классов, которые продуцируются под воздействием антигенов, расположенных на клеточной мембране и жгутиках микроорганизма.
На сегодняшний день разработано большое количество методов серологической диагностики. Разновидностью этих методов является ИФА – иммуноферментный анализ, относительная простота в исполнении которого, позволяет проводить широкие эпидемиологические обследования до начала лечения.
Определение специфических антител к Helicobacter pylori методом ИФА выявляет факт инфицирования не только при манифестных, но и субклинических формах инфекции, а также в стадии ремиссии заболевания. Иммунологические тесты диагностики используются для проведения эпидемиологических исследований и при длительном (на протяжении нескольких лет) наблюдении за больными после лечения. Тест остается положительным после лечения до 6 месяцев. Поэтому для контроля за эрадикацией Нр-инфекции серологические тесты использованы быть не могут.
Принцип метода ИФА основан на том, что на поверхности полистероловых планшетов или шариков (твердая фаза) сорбирован антиген к H.pylori. После инкубации сыворотки с твердой фазой соответствующие антитела H.pylori (в случае их наличия в сыворотке крови) связываются с сенсибилизированной полистероловой поверхностью. На следующем этапе к образовавшемуся комплексу антиген–антитело добавляют коньюгат пероксидазы хрена с антителами к тестируемому (сывороточному) компоненту иммунного комплекса. В случае искомого агента в крови возникает «сэндвич», содержащий антиген твердой фазы – тестируемое антитело сыворотки крови - антитело к тестируемому антителу, коньюгированное с пероксидазой. Добавление к образовавшемуся «сэндвичу» специального субстрата (ортофенилендиамин) обеспечивает проявление ферментной реакции и возникновение оранжевого окрашивания, учитываемого фотометрически. Интенсивность окраски субстратного раствора пропорциональна концентрации тестируемого маркера в сыворотке крови.
«Быстрая» серологическая диагностика проводится при помощи визуального экспресс-теста по определению в 2-х каплях цельной крови человека, а также в сыворотке или плазме IgG-антител к Helicobacter pylori одностадийным иммунохроматографическим методом. В экспресс-тесте применяют комбинацию таких специфических реагентов, как коньюгированные с красителем моноклональные антитела к IgG человека (нанесенные на мембрану, находящуюся внутри реакционной пластинки), высокоочищенные белки H.pylori, привязанные к мембране в районе тест-зоны, и козьи поликлональные антитела к IgG мыши в контрольной зоне. Образец материала наносится на диагностическую пластинку. При проникновении через адсорбционный слой к мембране, IgG человека связываются с коньюгатом, образуя иммунный комплекс. Если в нем присутствуют специфические антитела к H.pylori, иммунокомплекс будет реагировать с белками H.pylori в тест-зоне с появлением красно-фиолетовой полосы. Избыток коньюгата проникает в контрольную зону и связывается с антимышиными антителами.
Оценка результатов анализа:
Результат считается отрицательным, если в верхней контрольной зоне окна видна только одна красно-фиолетовая полоса, демонстрирующая пригодность реагентов набора к работе.
Результат считается положительным, если в нижней тест-зоне окна появляется вторая красно-фиолетовая полоса, свидетельствующая о присутствии в образце Ig G-антител к H.pylori. Причем, даже слабоокрашенная полоса указывает на положительный результат.
Результат считается неопределенным, если отсутствует полоса в контрольной зоне.
Однако, использование у детей для диагностики Нр-инфекции «быстрых» серологических тестов ограничено тем, что до 10 лет результаты часто остаются отрицательными при наличии бактерий в слизистой оболочке желудка пациента. Возникает так называемый «серый коридор», когда визуализация инфекции затруднена и необходимо использовать другие методы диагностики.
Лабораторно-диагностические методы позволяют не только определить одну из причин гастродуоденальной патологии, но и контролировать эффективность лечения, оценивать эрадикацию возбудителя. Оценивая информативность, доступность и экономические затраты на проведение различных методов диагностики, небходимо отметить, что следует руководствоваться принципом выбора метода, который с большой вероятностью даст точный результат за короткое время, или если есть возможность сочетания методов, информационно дополняющих друг друга.
Таким образом, диагностика Нр-инфекции является необходимым этапом в работе с пациентом, страдающим гастродуоденальной патологией, ассоциированной с Нр-инфекцией. С позиции доказательной медицины эффективность эрадикации Нр необходимо подтверждать лабораторно-диагностическими методами. Широкое внедрение диагностических тестов в практическую медицину для детекции Нр-инфекции даст возможность разрабатывать профилактические мероприятия, направленные на снижение заболеваний, ассоциированных с Нр-инфекцией у детей и взрослых. Перспективный подход в диагностике данной инфекции, вероятно, будет включать не только определение возбудителя и его особенностей (генетические и как следствие биохимические свойства), но и состояние макроорганизма, его иммунологический статус. Дальнейшие исследования по оптимизации диагностических комбинаций позволят упростить контроль за одной из широко распространенных инфекций человечества.