Молекулярный метод.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) впервые была осуществлена в 1985 году на фирме Cetus, а последующее использование в ПЦР термостабильной ДНК-полимеразы существенно расширило возможности её применения в научных целях, и в клинике.

ПЦР метод, который позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации и многократно размножить его. Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК и комплементарного дополнения обеих цепей ДНК. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках. Суть метода заключается в том, что, маркировав такими блоками специфический только для данного вида участок ДНК, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок.

Принцип метода.

Для того чтобы осуществить такой процесс в пробирке, используют две генетические пробы, называемые праймерами, которые и служат в качестве затравки для синтеза выбранного участка ДНК. При внесении в исследуемую пробу праймеры подобно паре генетических детективов «прочесывают» раствор в поисках участка, которому они комплементарны и, следовательно, способны присоединится, образовав двунитчатый стартовый участок. После присоединения (отжига) праймеров начинается воспроизведение с помощью фермента Tag–полимеразы специфического участка ДНК. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации – это и есть цепная реакция в ПЦР. В результате количество копий фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии и через 25 циклов амплификации синтезируются 10⁶ степени копий фрагмента. В течение 30-40 циклов нарабатывается количество ДНК, достаточное, чтобы учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле.

Материалом для исследования являются биоптат СОЖ или ДПК, а также желудочный сок. При заборе биоптатов для постановки ПЦР необходимо отбирать материал из антрального отдела желудка, наиболее излюбленное место прикрепления к эпителиоцитам, и фундального отдела желудка (в 10% случаев местом локализации Нр является именно дно желудка). Верификация микроорганизма ПЦР позволяет не только дать ответ на вопрос о наличии бактерии, но и выявлять маркеры генов «острова патогенности» - Cag, Vac, ice и др. Выделенная из биопсийных материалов ДНК Нр может быть использована для точечных мутаций в позиции 2142 и 2143 гена 23S РНК, ответственных за устойчивость к макролидам.

Проводятся перспективные исследования по модификации молекулярного метода с появлением новых технологий и современного оборудования. “Real-time” ПЦР продолжение совершенствования молекулярной диагностики с использованием прибора типа LightCykler, который позволяет в реальном времени осуществлять детекцию Нр и его мутации, приводящие к резистентности к антибиотикам.

Большое внимание уделяется исследованиям по выявлению ДНК Нр с последующей детекцией из копрофильтратов. Развитие данного направления, в случае получения достоверных результатов, значительно упростило бы диагностику Нр-инфекции с использованием неинвазивного метода. Однако пока существуют технологические трудности разработки данной методики.