Бактериологический метод.
Данный метод является «золотым стандартом» диагностики Нр-инфекции. Он основан на идентификации возбудителя путем посева из биоптата СОЖ или ДПК. Полученные при эндоскопии биоптаты помещают в пробирки с транспортными средами: Cary-Blaer или Pylori-средой. Посев материала желательно проводить в день его поступления в лабораторию. Для культивирования и выделения H.pylori используется неселективная среда (колумбийский агар – 43 гр., дистиллированная вода - до 1000 мл, 100 мл цельной крови барана) и селективная среда (колумбийский агар - 43 гр., дистиллированная вода - до 1000 мл, 100 мл цельной крови барана, полимиксина В-2500 UI/л, ванкомицин-10 мг/л триметоприм -5мг/л, амфотеррицин-10 мг/л, трифенилтетразол хлорид (ТТХ)-40 мг/л среды.
Типичные колонии - негемолитические, плоские, реже выпуклые, подобные каплям росы, влажные, прозрачные или полупрозрачные, с блестящей поверхностью на чашке с неселективной средой и с золотисто-желтым отливом на чашке с селективной средой. При микроскопии мазков окрашенных по Граму - клетки H.pylori грамотрицательные, мелкие, изогнутые или спиралевидные. При микроскопии в темном поле клетки H.pylori обладают характерной стремительной подвижностью.
Для изучения чувствительности H.pylori к кларитромицину, амоксициллину и метронидазолу используются следующие тесты: Е-тест, дискодиффузный метод, метод диффузии в агар для определения минимальной поглощающей концентрации (МПК). Несмотря на то, что этот метод самый точный, он редко используется в обычной клинической практике из-за длительности анализа (средняя продолжительность исследования 7 дней), сложности его постановки и высокой цены. Чаще всего бактериологический метод используют в качестве референсного для оценки точности других методов.
Морфологический метод.
Гистологический метод (ГМ) позволяет непосредственно визуализировать Нр. Используя специальные окраски: по Вартину-Старри, Гимзе, Генте можно добиться высокой вероятности микроскопической идентификации микроорганизмов по сравнению с окраской гематоксилином и эозином. Материалом исследования является биоптат СОЖ или ДПК. Преимуществом ГМ является простота исполнения, удобство хранения, транспортировки. При исследовании биоптата возможно определение степени обсемененности: выявление до 20 микроорганизмов в поле зрения - 1 степень, до 50 бактерий – 2 степень, свыше 50 бактерий 3 степень. Кроме этого оцениваются морфологические изменения слизистой оболочки, активность процесса с определением местонахождения полиморфноядерных лейкоцитов. Нейтрофилы могут инфильтрировать собственную пластинку, эпителий, заполнять просветы желез, образуя так называемые ямочные абсцессы. О хронизации процесса свидетельствуют лимфоциты, которые в норме в СОЖ содержатся не более 2-5 в поле зрения (объектив ×40) или 2-3 мононуклеара в одном валике. Наличие даже 1-2 плазмоцитов свидетельствует о хроническом воспалении. Для получения оптимальной информации рекомендуется обязательно проводить множественные биопсии. Их должно быть не менее пяти: по две из антрального отдела (2-3 см от привратника по большой и малой кривизне), по две из тела желудка (по большой и малой кривизне, примерно в 8 см от кардии) и по одной из угла желудка. Биопсии из тела важны при контроле за лечением. При неудачной антихеликобактерной терапии и лечении блокаторами протонового насоса Нр нейтрофилы часто исчезают из антрума, но появляются в теле желудка. Необходимо помнить, что ценность диагностической эндоскопии без правильно взятых биопсий весьма сомнительна, так как сама по себе не способна дать нозологического диагноза. Однако кроме достоинств у гистологического метода есть и свои недостатки: обнаружить Нр удается только на достаточно тонких и хорошо окрашенных средах. Трудно обнаружить Нр при его низкой обсемененности. Сложно отличить кокковую форму Нр от других форм микроорганизмов, которые тоже могут иметь спиралевидную форму.
Цитологический метод является одним из вариантов гистологического исследования. Материалом являются мазки-отпечатки биоптатов СОЖ, взятых при ЭГДС, которые в последующем высушиваются и окрашиваются по методу Романовского-Гимзе.
Возможные морфологические изменения, характерные для инвазии H.pylori.
Бактерии образуют межгликокалисные связи с клеточной мембраной без ее нарушения.
Плотный контакт бактериальной оболочки и клеточной мембраны вплоть до слияния их мембран.
Инвазия бактерии в собственную пластинку СО (как правило возникает при снижении общего иммунитета)
Метод флуоресцентной гибридизации in situ предоставляет возможность совершенствовать морфологическое определение микроорганизма. Для этого исследуемые срезы обрабатывают нуклеотидами с флуоресцентной меткой. Меченые нуклеотиды могут быть подобраны для детекции 16S рибосомальной РНК (определение Нр) или определения 23S рибосомальной РНК (выявление резистентности к макролидам).