Практическая работа № 5 (2 ч) Санитарно-микробиологическая экспертиза качества зерна

Цель работы: определить количество эпифитных микроорганизмов на зерне и выявить их качественный состав

Материалы и оборудование:

Зерно ячменя, овса или других культур; часовые стекла; металлические ложки; пинцеты; весы и разновесы; колбы с 50 мл сте­рильной водопроводной воды и 3 г песка; колбы емкостью 250 мл с 90 мл воды; стерильные моровские пипетки на 10 и 1 мл; стерильные чашки Петри; МПА в пробирках; водяная баня; треножник; микроскоп и все необходимое для препаратов и микроскопирования.

В зрелом све­жем зерне влага находится в связанном состоянии и недоступна микроорганизмам, поэтому они сохраняются здесь в состоянии покоя (анабиозе). На таком зерне находятся в основном не образующие спор бактерии рода Erwinia herbicola, округлые и плоские колонии которых обычно имеют оранжево-морковный цвет. Преобладание Erwinia herbicola в микробном ценозе зерна служит показателем его хороших качеств. На семенах, потерявших всхожесть, неспорообразующая бактериальная флора заменяется не только спорообразующими бактериями, но и грибами, которых на здоровых зернах мало.

Если зерно хранится при повышенной влажности, разви­тие микробиологических процессов приводит к повышению температуры (происходит так называемое явление термогенеза). При самосогревании зерна свойственная ему эпифитная микрофлора быстро исчезает, а ей на смену обильно размно­жаются не образующие спор палочковидные бактерии, фор­мирующие непигментированные колонии, которые, в свою очередь, вытесняют Erwinia herbicola. Позднее появляются термотолерантные формы, в частности микрококки, чаще все­го образующие на плотных средах белые плоские колонии, плесневые грибы и актиномицеты. Дальнейшее развитие про­цесса саморазогревания (выше 40-50⁰) способствует развитию термофильных бактерий и бацилл, кроме того, происходит смена видового состава плесневых грибов: Penicillium, которые преобладали вначале, заменяются Aspergillus.

Таким образом, по видовому составу микрофлоры можно судить не только о том, подвергалось ли зерно самосогреванию, но и насколько далеко зашел этот процесс.

Для выявления эпифитных микроорганизмов на стерильное часовое стекло помещают 5 г семян и, соблюдая все правила асептики, переносят их в колбу, содержащую 50 мл сте­рильной водопроводной воды и несколько граммов стериль­ного песка. Семена с водой взбалтывают в течение 10 мин, затем готовят разведения (10^-2, 10^-3, 10^-4). Из разных разведений (обычно третьего и четвертого) делают поверхностный или глубинный посев (на МПА). Через 3-5 суток инкубации подсчитывают общее число колоний на чашках, затем пересчитывают полученные данные на 1 г зерна. Для определения качественного состава микро­флоры колонии группируют по культуральным признакам, из каждой группы бактерий готовят окрашенные препараты и выявляют принадлежность к роду и виду. На основании такого анализа делают заключение о качестве зерна.

Практическая работа № 6 (2 ч) Санитарно-микробиологическое исследование плодоовощной продукции

Цель работы: Количественный учет и определение состава микрофлоры плодов и овощей

Материалы и оборудование: Свежие зрелые неповрежденные плоды или ово­щи; весы и разновесы; часовые стекла; колбы со стерильной водопроводной водой по 90 и 50 мл (в колбе с 50 мл воды 2-3 г песка); стерильные пипетки Мора на 10 и 1 мл; водяная баня; треножник; пробирки; заполненные на 2/3 объема питательной средой (МПА).

Для отбора пробы исследуемых плодов или овощей с поверхности поверхности нескольких из них фламбированным скальпелем срезают верхний слой в нескольких местах, помещают в стерильное часовое стекло известной массы и взвешивают навеску массой 5 г.

Далее используют метод смыва или соскоба. Смыв с определенной поверхности выполняют стерильным увлажненным водой тампоном, соскоб - металлическим заостренным шпателем, причем снимают тонкий поверхностный слой около 1 мм с площади примерно 1 см². Материал переносят в колбу. Пробы берут с соблюдением строгих условий асептики (стерильная посуда, работа вблизи горелки).

Навеску массой 5 г помещают в колбу с 50 мл воды с песком. Колбу взбалтывают круговыми вращательными движениями 10 мин. Из полученной суспензии готовят разведения 10^-2, 10^-3, 10^-4. Иногда разведения могут быть больше, это зависит от обсемененности иссле­дуемого объекта. Разведения 10^-5, 10^-6 используют для анализа микро­флоры перезревших ягод и плодов с остатками почвенных загрязнений и овощей, выращиваемых в почве (10^-2 – для яблок).

Отдельными стерильными пипетками Мора берут по 10 мл суспен­зии и переносят в колбы, содержащие по 90 мл стерильной водопро­водной воды. Затем из каждой колбы берут по 1 мл суспензии соответ­ствующего разведения в стерильные чашки Петри в двух повторностях. В каждую чашку Петри выливают по 1 пробирке расплавленного, но предварительно охлажденного до 50⁰С МПА. Чашки инкубируют при 30⁰С. Наряду с МПА используют питательную среду сусло-агар с мелом.

Через 3-5 дней инкубации подсчитывают общее число колоний, выросших на МПА в чашках, и рассчитывают количество микроорганизмов в 1 г. Для этого отбирают для подсчета наиболее подходящее разведение (количество колоний должно быть не менее 50 и не более 100). Подсчитывают все колонии (крупные и мелкие), умножают на степень разведения и определяют количество микроорганизмов в 1 г анализируемого образца. Вычисляют среднее арифметическое на основании подсчета числа колоний в двух чашках.

Для определения качественного состава микрофлоры колонии группируют по культуральным признакам, описывают форму колоний, цвет, поверхность, консистенцию. При необходимости из каждой группы колоний готовят препараты, выявляют принадлежность микроорганизмов к определенному роду и устанавливают численность бактерий каждой группы в про­центах от общего количества микроорганизмов.

На основании микробиологического анализа делают заключение о качестве продукта. Так, на свежих плодах и овощах преобладают дрожжи, образующие блестящие, выпуклые, часто окрашенные в розовые тона колонии; неспороносные бактерии родов Lactobacillus и Acetobacter (хорошо выявляются на сусло-агаре с мелом и имеют вид чечевицеобразных мелких колоний с зонами растворения мела вокруг), Pseudomonas и др. В незначительном количестве встречаются блестящие колонии Erwinia herbicola оранжевого цвета. На свежем доброкачественном зерне этот вид преобладает (до 80 %). Встречаются желтовато-зеленые колонии с характерной флуоресценцией (Pseudomonas fluorescens) и колонии дрожжей. На сусло-агаре с мелом выявляются бактерии рода Lactobacillus.

Если анализируют несвежие овощи, фрукты или зерно, прежде всего обнаруживают: грибы родов Penicillium и Aspergillus; микрококки, образующие мелкие белые блестящие плоские непрозрачные колонии; спорообразующие палочки, колонии которых обычно в проходящем свете непрозрачны. Встречаются и актиномицеты, образующие плотные кожистые колонии, как бы ввинченные в среду, часто выделяющие пигмент, который особенно хорошо просматривается со стороны дна чашки.

Принадлежность выявленных микроорганизмов к эпифитной микрофлоре можно определить, выяснив их отношение к фитонцидам. Для этого в чашки Петри на агаризованную среду с танином или экстрактом фитонцидов делают посев штрихом заведомо неэпифитного микроорганизма (например, Azotobacter или Bacillus mycoides), известного эпифита (например, Erwinia herbicola) и испытуемой культуры. Если исследуемый микроорганизм эпифит, то вырастают два штриха; контрольный неэпифитный микроорганизм расти не должен.