19.2. Иммобилизованные ферменты

Иммобилизация ферментов — это повышение их стабильности. В биологических объектах ферменты находятся в фиксированном состоянии на поверхности различных клеточных структур и сохраняют актив­ность в течение длительного времени. В то же время выделенные из органов и тканей или полученные из микробного сырья, особенно в высоко очищенном состоянии, они быстро инактивируются. Поэтому повседневное клиническое использование нативных ферментов лимитируется прежде всего их высокой лабильностью к различным факторам окружающей среды (значение рН, температура и др.), быстрой инактивацией в организме и выделением из организма, что повышает расход ферментов, а также наличи­ем антигенных свойств чужеродных организму бел­ков. Перечисленные недостатки в значительной степе­ни могут быть устранены при использовании фермен­тов в иммобилизованном виде.

При создании иммобилизованных ферментов, при­меняемых в медицине, определили два направления:

1. когда присутствие фермента необходимо в разных органах или он предназначен для длительной цирку­ ляции в кровотоке, получают его стабилизированные водорастворимые формы. К этой группе могут быть отнесены и искусственные клетки, наполненные фер­ ментами: микрокапсулы, липосомы и клетки крови;

2. при лечении очаговых заболеваний целесообразны иммобилизованные ферменты, которые могут быть локализованы в определенном месте организма и спо­ собны к его выделению с заданной скоростью в окру-

16* 483

жающую среду. Однако необходимость введения иммобилизованного фермента в организм отпадает, если он действует на субстрат, присутствующий в биологических жидкостях. В этих случаях исполь­зуют системы экстракорпоральной перфузии, помещая иммобилизованный фермент в закрытую систему, через которую циркулирует биологическая жидкость (кровь, лимфа и др.), возвращающаяся в организм освобожденной от вредного метаболита.

Водорастворимые препараты иммобилизованных ферментов. Высокомолекулярные водорастворимые производные ферментов на данном этапе развития медицинской энзимологии являются их наиболее рациональными формами. Фермент и полимер, как правило, соединены ковалентной связью. Молекула фермента обволакивается макромолекулой полимера в результате образования между ними 6—10 ковалент-ных связей. Многоточечное взаимодействие фермента с носителем делает его конформацию более жесткой и менее подвижной. Фермент оказывается заклю­ченным в полимерную оболочку, имеющую вид петель и достаточно хорошо проницаемую для высокомоле­кулярных субстратов. Поэтому такие соединения получили название «открытые» макромолекулярные капсулы. Водорастворимые полимерные производные ферментов характеризуются повышенной стабильно­стью in vitro и in vivo, увеличенным временем цирку­ляции в кровотоке, что обусловливает пролонгирова­ние их действия в организме. Они оказывают менее выраженное побочное действие, что связано с пони­женной по сравнению с нативными ферментами способностью стимулировать образование антител и реагировать с ними вследствие затруднений для специфического взаимодействия антиген — антитело. Положительные качества ферментов, модифициро­ванных водорастворимыми полимерами, открывают широкие перспективы для их клинического исполь­зования. Определенные успехи в этом направлении достигнуты при применении в клинике иммобилизо­ванных протеаз в качестве фибринолитических и про­тивовоспалительных препаратов. Особое значение в этой связи приобретают разработка и внедрение в клинику стрептодеказы.

Стрептодеказа для инъекций (Strep-todecasum pro injectionibus) — первый препарат про-

484

*~ локированного действия для тромболитическои тера­пии, полученный на основе иммобилизованного фибри-нолизина (стрептокиназы) и разрешенный к медицин­скому применению в 1981 г. Над созданием препарата работали коллективы ВНИИ ТИАФ, Всесоюзного кардиологического научного центра (ВКНЦ) АМН СССР и ИОС АН Латвии.

В качестве водорастворимого полимера-носителя для иммобилизации стрептокииазы использован дек-стран с м.м. 60 000, выпускаемый под названием полиглюкин. Предварительное активирование поли-глюкина проводят калия периодатом при комнатной температуре и перемешивании раствора в течение 1 ч. Очистку окисленного полиглюкина от примесей осуществляют хроматографической адсорбцией.

Для иммобилизации стрептокиназы к ее раствору приливают раствор окисленного полиглюкина, имею­щего значение рН 8,7, и перемешивают в течение 1 ч. Аминогруппы стрептокиназы и альдегидные группы окисленного полиглюкина взаимодействуют с образо­ванием азометиловой связи. Затем реакционную смесь охлаждают до 4 °С. Последующее восстановление стрептодеказы проводят при добавлении к реакцион­ной массе натрия боргидрида и перемешивании в течение 1 ч при температуре 4 °С. Азометиловые связи (—CH-N —) между полимером и белком вос­станавливаются до НчС—NH-связей, а избыток аль-

"I I

дегидных групп полимера (реакционные группы, оставшиеся после реакции) — до гидроксильных. После определения фибринолитической активности раствор концентрируют с помощью ультрафильтрации. Концентрат подвергают стерилизующей фильтрации и затем сублимационной сушке.

Препарат представляет собой порошок или пори­стую массу белого цвета. Выпускают в герметически укупоренных флаконах вместимостью 10 мл, содержа­щих по 1 500 000 или 1 000 000 ФЕ (фибринолитиче­ских единиц) стрептодеказы (в пачках по 2 флакона). Хранят по списку Б, при температуре не выше 10 °С. Стрептодеказу обычно в дозе 2 700 000 ФЕ (через 1 ч после пробной инъекции 300 000 ФЕ) вводят однократно, внутривенно, струйно, растворяя непо­средственно перед применением в 20—50 мл изотони­ческого раствора натрия хлорида. В этой дозе препа-

485

■ж

рат вызывает значительное повышение фибринолити-ческой активности крови и действует в течение 48—72 ч.

Включение ферментов в микрокапсулы. Микро-капсулирование ферментов состоит во включении их водных растворов в полупроницаемые мембраны толщиной около 20 им, непроницаемые для ВМС и клеток, но через которые могут проникать низко­молекулярные вещества. Наличие ультратонкой мем­браны позволяет создать высокие концентрации фер­мента в малых объемах раствора, находящегося в микрокапсуле, и сохранять стабильность и биоло­гическую активность инкапсулированных ферментов. Использование фермента в высоких концентрациях, а также большие значения отношения площади по­верхности микрокапсул к их объему обеспечивают быструю диффузию низкомолекулярного субстрата из внешней среды к ферменту и продукта реакции из внутреннего объема микрокапсулы в межкапсулярное пространство.

Получены и исследованы микрокапсулированные формы ряда ферментов, катализирующих различные превращения низкомолекулярных субстратов. Так, микрокапсулированная каталаза, введенная внутри­венно или внутрибргошинно мышам с наследственным нарушением синтеза этого фермента, эффективно снижала содержание перборатов в крови и имела более длительный период жизни в организме, чем свободный фермент. Микрокапсулированная аспара-гиназа, введенная мышам с аспарагинзависимымн опухолями, вызывала стойкое и длительное снижение аспарагина в крови, что препятствовало росту зло­качественных новообразований. Микрокапсулирован­ная уреаза после введения крысам в желудочно-кишечный тракт вызывала существенное понижение содержания мочевины в крови. Следует отметить, что все исследования микрокапсулированных ферментов проводятся только на животных. Это связано с тем, что при интракорпоральном их введении материал, используемый для создания мембран, накапливается в основном в селезенке и печени и может быть далеко не безразличен для организма.

Идеальным материалом с точки зрения биологиче­ской утилизации микрокапсул в организме человека и животных могут быть различные природные мембра-486

ны клеток крови. Фермент при относительно мягких условиях (нейтральная среда, небольшая ионная сила и т. д.) может быть заключен в частично гемоли-зованные клетки крови (эритроциты, тромбоциты) с последующим восстановлением целостности их мем­бран. Поскольку размер ферментных элементов крови мал, а время жизни их в кровяном русле относительно велико, такие микрокапсулы могут беспрепятственно и длительно циркулировать в крови. В форменные элементы крови включены такие ферменты, как р-глю-козидаза, р-галактозидаза, а-амилаза, пероксидаза, аргиназа, аспарагиназа и некоторые другие. Все иммобилизованные в клетки крови ферменты имеют неизменяемые каталитические параметры и отличают­ся большей устойчивостью к повышению темпера­туры.

Применение микрокапсул, содержащих ферменты, экстракорпорально через шунты или камеры имеет хорошую перспективу. Одно из преимуществ состо­ит в том, что не происходит контакта фермента с иммунокомпетентными клетками, тем самым исклю­чается возмодность сенсибилизации организма со всеми неблагоприятными последствиями. Кроме того, применение вне организма исключает накопление в нем искусственных клеток и снимает проблему разрушения и утилизации полимерных материалов. Благодаря ультратонкой полупроницаемой мембране и высоким значениям отношения площади поверхности микрокапсул к их объему, скорость диффузии низко­молекулярных веществ через микрокапсулы выше, чем через диализную мембрану в аппарате искусствен­ная почка. Принцип энзиматического превращения вредных метаболитов с помощью микрокапсулирован­ных ферментов разрабатывается для применения в аппаратах искусственная почка и искусственная печень. Перспективным может оказаться использова­ние микрокапсулированных ферментов для удаления мочевины — одного из самых токсичных метаболитов клетки. Одним из способов является превращение мочевины под действием микрокапсулированнои уреа-зы в аммоний и углерода диоксид. Вторым — исполь­зование экстракорпорального шунта, снабженного микрокапсулами с мультиферментными рециклиру-ющими комплексами. С помощью таких микрокапсул, благодаря сложной цепи рециклирующих реакций,

487

мочевина и аммоний превращаются в аминокислоты: глутамат, оксиглутарат, аланин.

Включение ферментов в липосомы. Липосомы — бислойные сферические образования с водной фазой внутри и размером несколько сотен ангстрем или полибислойные образования, состоящие из нескольких концентрических бислоев с внутренней полостью и раз­мером до многих сотен ангстрем и даже до 1 мкм. Для получения липосом ферменты или другие биоло­гически активные вещества в водных растворах подвергают ультразвуковой обработке в присутствии положительно или отрицательно заряженных фосфо-липидов.

Липосомы после разрушения составляющих их фосфолипидов могут быть утилизированы как компо­ненты клеточных мембран. Кроме того, они дают уникальную возможность введения фермента внутрь клеток, с которыми взаимодействуют. В зависимости от физических параметров фосфолипидов (заряд, жидкость, размер) липосомы проникают в клетку посредством эндоцитоза или за счет слияния с при­родными мембранами. При эндоцитозе липидная оболочка липосом внутри клеток разрушается фосфо-липазами лизосом и лекарственное вещество осво­бождается в цитоплазму; при слиянии с клеточной мембраной липидный компонент липосом входит в состав клеточных мембран, а его лекарственное содержимое поступает в цитоплазму.

Распределение липосом по различным органам при их введении животным детально изучено. Основная их часть (от 50 до 80%) поглощается клетками ре-тикулоэндотелиальной системы, в первую очередь на­ходящимися в печени и селезенке. Свойство липосом избирательно концентрироваться в клетках ретикуло-эндотелиальной системы использовано для лечения генетически обусловленных нарушений синтеза и функ­ционирования лизосомальных гидролаз печени. При этом следует отметить, что пораженная печень на­капливает в несколько раз больше липосом, чем здо­ровая. При лечении ферментом, включенным в липо­сомы, больного с дефицитом лизосомальной а-глюко-зидазы, сопровождающимся усиленным накоплением гликогена в печени, наблюдали быстрое (в течение недели) снижение уровня гликогена и уменьшение размера печени. Положительный терапевтический эф-

488

фект на людях отмечен при использовании включен­ной в липосомы глюкоцереброзидазы при болезни Гоше, связанной с нарушением метаболизма глюко-цереброзидов-, накапливающихся в клетках ретикуло-эндотелиальной системы в результате дефицита соот­ветствующего лизосомального фермента.

Направленность действия липосом (органотроп-ность) может быть изменена при изменении состава компонентов, образующих мембрану, а сродство ли­посом к клеткам-мишеням усилено с помощью спе­цифических факторов (антитела, лектины и др.).

Препараты иммобилизованных ферментов, приме­няемые при локальных заболеваниях. При локальных заболеваниях целесообразно использование иммоби­лизованных ферментов, которые могут быть локали­зованы в определенном месте организма и способны к постепенному выделению в окружающую среду. При получении таблеток и гранул ферментных препара­тов (трипсина, лизоцима, щелочной фосфатазы, ка-талазы и др.) предложено вводить их в смеси с био­совместимыми полимерами (полиакриламидом, поли-винилпирролидоном, спиртом поливиниловым и др.). Имплантированный в очаге поражения или поблизос­ти от него находящийся в полимере фермент прак­тически полностью защищен от воздействия агрессив­ной физиологической среды. Вместе с тем из полимера фермент выходит в нативном состоянии и скорость его последующей инактивации и выведения, как и вы­зываемые им токсические, аллергические и иммунные реакции, та же, что и для нативного фермента, при­меняемого традиционным способом.

Перспективны рассасывающиеся в организме фер-м«нтосодержащие препараты, которые с помощью катетеризации могут вводиться непосредственно в мы­шечную ткань или капиллярную сеть пораженного органа и поддерживать там высокую локальную кон­центрацию стабилизированного фермента.

В качестве полимерного носителя использовали сефадекс, который предварительно окисляли кислотой йодной или натрия перйодатом. Полученные при окис­лении альдегидосефадексы способны к медленному растворению. Изменение степени окисления позволяет варьировать их растворимость в самых широких пре­делах. Иммобилизованный на таком носителе фермент переходит в раствор ковалентно связанным с оскол-

489

ком (фрагментом) носителя, который не только до­полнительно его стабилизирует, но и уменьшает вы­зываемые ферментом нежелательные реакции орга­низма.

Иммобилизованные на частично окисленных поли­сахаридах тромболитические ферменты показали боль­шую перспективность для терапии тромбозов. Лизис тромба достигается меньшей дозой иммобилизован­ного фермента, депонируемого непосредственно в мес­те расположения тромба методом катетеризации.

К биодеградируемым препаратам могут быть от­несены ферменты, иммобилизованные в структуре полимерных волокон и пленок в процессе их форми­рования. Различают обычные и полые волокна. Для получения обычных волокон к раствору полимера (триацетатцеллюлоза, нитроцеллюлоза, этилцеллю-лоза, поливинилхлорид и др.) в органическом раство­рителе добавляют водный раствор или суспензию фер­мента. Смесь эмульгируют и продавливают через мел­кое сито в коагулируемую жидкость. Образующиеся волокна представляют собой полимерные гели, кото­рые содержат в структуре водный раствор фермента. Полые волокна изготавливают из природных или син­тетических полимеров, таких как целлюлоза, поли­винилхлорид, полисульфон, полиакриламид, нейлон. Полые волокна состоят из основной массы полимер­ной матрицы, которая имеет внутреннюю полую об­ласть, заполненную раствором фермента. Он удер­живается в полой области волокна за счет физиче­ской иммобилизации или химической связи между аминогруппами фермента и активными группами, находящимися на внутренней поверхности волокна. Каталитические свойства ферментов, включенных в волокна, используются в медицине в экстракорпораль­ных шунтах для детоксикации организма при различ­ных патологических состояниях и в терапии субстрат-зависимых опухолей, а также в ферментативных реак­торах при диагностических определениях концентра­ции метаболитов в крови. Так, уреаза, включенная в волокна из триацетатцеллюлозы, химически сшитая с помощью глутарового альдегида с нейлоновыми трубками, эффективно снижала уровень мочевины в крови животных. Уреаза, иммобилизованная на ней­лоновых трубках, оказала положительный терапев­тический эффект при лечении больных, страдающих

490

гиперурикемией, обеспечив быстрое удаление уратов из кровяного русла. Подсоединение экстракорпораль­ных шунтов, содержащих аспарагиназу, включенную в волокна из триацетатцеллюлозы и дакрона или ко-валентно пришитую за счет глутарового альдегида к внутренней поверхности нейлоновых трубок, при­водило к полному удалению аспарагина из кровяного

русла животных.

Протеолитические ферменты, включенные в сис­тему нерастворимых (фторопласт-42 и др.) и раство­римых (ПВС и др.) в воде полимеров, используются при гнойных ранах. Фермент выделяется благодаря диффузии или постепенному растворению пленки. Применение полимерных пленок ускоряет очищение ран в 3—4 раза, расход фермента на курс лечения снижается приблизительно в 20 раз.

Контрольные вопросы

1. Перечислите ферментные препараты, получаемые из микроор­ ганизмов.

2. Объясните особенности выделения внеклеточных и внутрикле­ точных ферментов из микроорганизмов.

1. Укажите способы иммобилизации, наиболее рациональные для

ферментов.

4. Назовите особенности биодеградируемых ферментных препа­ ратов.

5. Как получают стрептодеказу? В какой лекарственной форме ее

выпускают? Как применяют?