15.2. Выделение вирусов

Многие вирусы выделяют с использованием их способности вызывать образование дискретных видимых зон, так называемых бляшек, в слое клеток хозяина. Если сомкнутый слой клеток инокулировать вирусом в концентрации, при которой заражается только небольшая часть клеток хозяина, бляшки могут формироваться как область клеток, убитых или поврежденных вирусной инфекцией. Каждая бляшка формируется, когда инфекция радиально распространяется от зараженной клетки в окружающие клетки. Бляшки формируют многие вирусы животных, когда монослой клеток заливается агарозным гелем для сохранения вирусного потомства в дискретной зоне. Бляшки также формируют бактериофаги на газоне культуры бактерий (слайд).

Предполагается, что бляшка является результатом заражения клетки единственным вирионом. Если это так, то все вирусы, находящиеся в бляшке, являются клоном, то есть должны быть генетически идентичными. Такой клон называют изолятом, и если он отличается от всех остальных изолятов, его называют штаммом. Это аналогично происхождению штаммов бактерий из колонии на поверхности агара.

Имеется вероятность, что бляшка берет происхождение от двух или более вирионов, поэтому для увеличения вероятности получения генетически чистого штамма вируса, материалом одной бляшки снова заражают монослой клеток, и выделяют вирус из отдельной бляшки. Про такой вирус говорят, что он был очищен методом бляшек.

Когда вирус выделяют впервые, он может плохо реплицироваться в клетках в лаборатории, однако после нескольких циклов репликации он может реплицироваться более эффективно. В результате таких пассажей вирус может стать генетически отличным от исходного дикого штамма, в таком случае вирус становится лабораторным штаммом.

15.2.1. Центрифугирование

После того, как вирус размножен, обычно необходимо очистить его от остатков клеток и других загрязняющих материалов, поскольку для исследований, для приготовления вакцин или для других целей чаще всего используют очищенные вирусные частицы. Обычным методом очистки является центрифугирование; частичная очистка достигается дифференциальным центрифугированием, и наивысшая степень очистки достигается центрифугированием в градиенте плотности.

Дифференциальное центрифугирование включает центрифугирование с низкой скоростью, после которых большинство вирионов остается в надосадочной жидкости, и высокоскоростное центрифугирование, после которого вирусы выпадают в осадок в виде гранул. На первом этапе центрифугирование проводят например при 10 000 g 20 минут, а на втором этапе – при 100 000 g 2 часа. Таким образом получают препарат частично очищенных вирионов.

При центрифугировании в градиенте плотности, вирусные частицы или молекулы типа нуклеиновых кислот центрифугируют в растворе с возрастающей концентрацией и соответственно плотностью. В качестве растворяемого вещества используют хорошо растворимые соединения; очень часто используется сахароза.

Имеется два типа центрифугирования в градиенте плотности: скоростное зональное и равновесное зональное центрифугирование (слайд). При скоростном зональном центрифугировании частично очищенные вирионы наносят на поверхность градиента; далее частицы движутся сквозь градиент, при этом скорость их движения зависит от коэффициента седиментации. Величина этого коэффициента зависит в основном от размера частиц. Однородные частицы, такие как вирионы вируса, движутся в градиенте в виде единой полосы, которую в дальнейшем можно собрать. Центрифугирование при этом заканчивают, когда частицы еще не достигают дна пробирки.

При равновесном зональном центрифугировании концентрацию раствора, создающего градиент, подбирают таким образом, чтобы плотность внизу градиента была гарантированно больше плотности очищаемых частиц. Частицы суспендируются в градиенте, и затем при центрифугировании они перемещаются в ту зону градиента, в которой плотность раствора такая же, как и у них. Плавучую плотность вирионов в градиенте раствора хлористого цезия используют в качестве одной из характеристик вирусных вирионов.