29. Что такое сплайсинг и альтернативный сплайсинг транскрипта? Какое значение имеет это явление для транскрипции геномов вирусов?

Сплайсинг транскриптов

В некоторых случаях первичные транскрипты являются функциональными матричными РНК, однако большинство первичных транскриптов эукариотических клеток имеют последовательности (интроны), которые в дальнейшем удаляются. Остающиеся последовательности, экзоны, соединяются вместе в специфических участках донорных и акцепторных сайтах сплайсинга, образуя мРНК. Первичный транскрипт может разрезаться и претерпевать сплайсинг более чем одним способом, что приводит к образованию двух или более типов мРНК из первичного танскрипта. Некоторые первичные транскрипты вирусов, репликация которых протекает в ядре, претерпевают подобный процессинг, формируя ряд мРНК. Первое доказательство существование таких «расщепленных генов» (split genes), то есть генов, которые «расщеплены» на экзоны и интроны, были получены именно при изучении аденовирусов в 1977 году. Только после этого были получены соответствующие доказательства для эукариот. Расщепленные гены в русскоязычной научной литературе еще называют прерывистыми генами.

Помимо аденовирусов, расщепленные гены имеют также герпесвирусы, парвовирусы и ретровирусы. Простейший тип расщепленного гена состоит из двух экзонов, разделенных одним интроном, но во многих случаях структура генов намного более сложная. Например, ген K15 ассоциированного с саркомой Капоши вируса герпеса имеет восемь экзонов и семь интронов. Геном ВИЧ-1 имеет ряд донорных и акцепторных сайтов сплайсинга; в результате сплайсинга первичного транскрипта образуется более 30 различных мРНК.

30. Как инициируется трансляция в клетках еукаріот? Как происходит трансляция моно- и поліцестронних мРнк?

Трансляция в клетках эукариот

В типичном случае мРНК эукариот являются моноцистронными, то есть имеют одну открытую рамку считывания (Open Reading Frame, ORF), с которой транслируется один белок (слайд). Последовательности выше и ниже ORF не транслируются. Некоторые большие ORF кодируют полипротеины, большие белки, которые разрезаются на два или более функциональных белка.

Инициация трансляции

Большинство мРНК клеток эукариот и вирусов, поражающих эукариоты, имеют метилированный нуклеотидный кэп на 5′-конце и поли(А) последовательность на 3′-конце. Эти структуры играют ключевую роль в инициации трансляции. Особенно важным является кэп; он представляет собой сайт связывания для факторов инициации эукариот (eukaryotic initiation factors, (eIFs) (слайд). Далее инициаторная метиониновая тРНК связывается со своей аминокислотой и 40S-субъединицей рибосомы. С поли(А) последовательностью на 3′-конце мРНК связываются специфически для данной последовательности белки. Белки, которые связываются с двумя концами мРНК, способны взаимодействовать друг с другом, и считается, что это взаимодействие приводит к замыканию мРНК в кольцо, что в свою очередь приводит к стимуляции трансляции. Матричные РНК, у которых отсутствует кэп или поли(А)-хвост, должны замыкаться в кольцо с использованием иных механизмов.

40S субъединица рибосомы перемещается вдоль мРНК от 5′ к 3′-концу, сканируя мРНК, пока не встретится первый инициирующий кодон. Чаще всего это кодон AUG, ближайший к 5′-концу. Метиониновая тРНК является инициаторной, поскольку именно с ее помощью, за счет кодон–антикодонового взаимодействия, сканирующий комплекс находит стартовый AUG-кодон. Как только такой кодон найден, к малой субъединице присоединяется большая 60S субъединица, т.е. собирается целая 80S рибосома, и начинается синтез полипептидной цепи.

Некоторые мРНК не имеют кэпа, и инициация трансляции происходит иначе. Сокращенный набор eIFs связывается не с 5′-концом, а с так называемым внутренним сайтом вхождения рибосомы (internal ribosome entry site, IRES), который имеет сложную вторичную структуру (слайд). Внутренние сайты вхождения рибосомы имеют ряд РНК-содержащих вирусов, такие как вирус гепатита С и пикорнавирусы, а также у одной из мРНК ДНК-содержащего ассоциированного с саркомой Капоши вируса герпеса.

Трансляция бицистронных мРНК

Большинство мРНК эукариотических клеток и вирусов имеют одну открытую рамку считывания, но имеется несколько вирусных мРНК, имеющих две или более ORFs. Некоторые из этих би- или полицестронных РНК являются функционально моноцистронными, но некоторые структурно бицистронные мРНК являются функционально бицистронными. Различие в интенсивности трансляции двух ORFs обеспечивает механизм экспрессии двух генов с разной интенсивностью.

У многих бицистронных мРНК открытые рамки считывания перекрываются (слайд) (а); в других случаях имеется одна ORF внутри другой ORF (b). Одним з механизмов чтения второй рамки считывания является «ослабленное» сканирование; 40S субъединица рибосомы может пропустить стартовый кодон ORF 1 и инициировать трансляцию со стартового кодона ORF 2.

Другим механизмом чтения второй ORF в мРНК является сдвиг рамки считывания (фреймшифт) рибосомы; рибосома смещается на другую рамку считывания по направлению к концу ORF 1. Таким образом рибосома не распознает стоп-кодон ORF 1 и продолжает перемещаться по мРНК, считывая ORF 2

(c). Сдвиг рамки считывания происходит тогда, когда рибосома, перемещаясь вдоль мРНК, встречает сигнал фреймшифта (специфическую последовательность), который сопровождается особой вторичной структурой.