2.10. Влияние азота и фосфора на рост микроорганизмов

Азот и фосфор относятся к важнейшим биогенным элементам, необходимым для роста всех клеток. Азот необходим для конструктивного обмена (синтеза белков), фосфор используется в конструктивном и энергетическом обменах, входя в состав таких биомолекул, как ДНК, РНК, фосфолипиды и АТФ.

Зависимость удельной скорости роста от концентрации азота и фосфора подчиняется уравнению Моно при величине константы Моно по азоту 0,1-0,5 мг/л, по фосфору 0,1-0,2 мг/л.

При лимитировании роста по азоту, а также одновременно по азоту и фосфору, клетки часто переходят на синтез безазотистых соединений, т.е. вместо белков синтезируются полисахариды, липиды и поли--оксимасляная кислота. Количество безазотистых соединений в клетке становится значительно больше нормального уровня, поэтому говорят о сверхсинтезе безазотистых соединений.

Данное явление используется в биотехнологии, например, для получения полисахаридов. В системах биологической очистки воды сверхсинтез полисахаридов играет отрицательную роль, ухудшая способность бактериальных хлопьев (хлопьев активного ила) к осаждению.

В условиях сверхсинтеза безазотистых соединений экономический коэффициент достигает аномально высоких значений, превосходящих величину истинного экономического коэффициента. Это связано с низкими затратами энергии на биосинтез полисахаридов и липидов, чем на биосинтез белков, соответственно, меньшая часть субстрата вовлекается в энергетический обмен (окисляется для получения энергии), и основная часть субстрата трансформируется в биомассу в ходе конструктивного обмена. Но образующаяся биомасса имеет аномальный состав с преобладанием тех или иных безазотистых соединений. Так, содержание липидов может достигать 70 % против 5-10 % в норме, а полисахаридов – до 80 %, против обычного их содержания в биомассе клеток около 15 %.

3. Культивирование клеток

3.1. Классификация методов культивирования

В зависимости от режима процесса выделяют периодическое и непрерывное культивирование.

Периодическое культивирование подразделяют на простое и отъемно-доливное. При простом периодическом культивировании в биореактор загружают свежую питательную среду и клетки, проводят процесс определенное время без добавок субстрата и отвода культуральной жидкости, затем реактор опорожняют и вновь повторяют цикл культивирования. Отъемно-доливное культивирование отличается тем, что после завершения процесса реактор полностью не опорожняют, а лишь удаляют (отнимают) часть культуральной жидкости (клетки остаются в реакторе) и затем доливают в реактор такой же объем свежей питательной среды.

Периодическое культивирование легко реализовать как в лабораторных, так и в промышленных условиях, но на практике оно применяется все же реже, так уступает непрерывному культивированию по производительности и стабильности. Из систем биологической очистки в режиме отъемно-доливного культивирования работают аэротенки периодического действия, иногда применяемые для очистки небольших объемов сточных вод.

Непрерывное (проточное) культивирование – это метод, при котором в биореактор непрерывно подается раствор субстрата и с тем же объемным расходом отводится суспензия клеток или культуральная жидкость. В зависимости от гидродинамического режима в биореакторе выделяют два основных типа непрерывного культивирования: тубулярная культура и хемостат. В тубулярной культуре биореактор по гидродинамическому режиму является идеальным вытеснителем. Хемостат – это установка непрерывного культивирования в реакторе идеального смешения при постоянной скорости разбавления.

В проточном реакторе-вытеснителе (тубулярной культуре) продольное перемешивание практически отсутствует, при этом условия среды и состояние микроорганизмов изменяются по длине реактора так же, как с течением времени в периодической культуре (рис. 3.1 а). На этой основе в лабораторных условиях тубулярную культуру часто моделируют путем периодического культивирования. Например, аэротенк-вытеснитель моделируется отъемно-доливным культивированием.

а)
б)
в)
г)

Условные обозначения:	 расход;  концентрация субстрата;  концентрация биомассы;  линейная координата;  длина биореактора.

Рис. 3.1. Схемы непрерывного культивирования: а) тубулярная культура без возврата биомассы; б) хемостат без возврата биомассы; в) батарея хемостатов; г) непрерывное культивирование с возвратом биомассы (система биологической очистки аэротенк-отстойник).

Принципиально другими свойствами обладает хемостат, позволяющий в течение длительного времени поддерживать стабильные условия среды и стабильное физиологическое состояние микроорганизмов (рис. 3.1 б). Кроме того, хемостат может устойчиво работать даже при отстутствии микроорганизмов в поступающей питательной среде.

Последовательно соединенные реакторы идеального смешения (батарея хемостатов) образует систему, приближающуюся по гидродинамическому режиму к идеальному вытеснению (рис. 3.1 в). Поэтому на практике биореактор-вытеснитель часто представляет собой батарею хемостатов.

Непрерывное культивирование может осуществляться без возврата и с возвратом биомассы в реактор. В режиме непрерывного культивирования без возврата биомассы работают биопруды, применяемые для доочистки сточных вод. Аэротенки относятся к реакторам непрерывного культивирования с возвратом биомассы. Микроорганизмы в аэротенках находятся в виде агрегатов, состоящих из тысяч слипшихся клеток. Эти агрегаты, называемые хлопьями активного ила, хорошо оседают при отстаивании. Поэтому для отделения биомассы от воды обычно используют отстойники. Аэротенк вместе с отстойником образует единую систему биологической очистки, работающую в режиме непрерывного культивирования с возвратом биомассы (рис. 3.1 г).

Клетки в биореакторах могут находиться в различных формах: суспендированные дисперсные клетки, суспендированные клеточные агрегаты (например, хлопья активного ила), иммобилизованные клетки (например, биопленки на твердых поверхностях), биогранулы размером 1-2 мм, состоящие из множества клеток.

В зависимости от кислородного режима выделяют аэробное и анаэробное культивирование. Кроме того, при биологической очистке от азота используют аноксидное культивирование (в биореакторе отсутствует растворенный кислород, но имеется химически связанный кислород в виде нитритов и нитратов).