Подходы к диагностике

Непосредственными причинами болезней импринтинга являются не только генетические нарушения (точковые, структурные и хромосомные мутации), но и функциональные нарушения, связанные с взаимодействием между импринтированными и неимпринтированными генами в критических областях хромосом.

В случае мутаций диагностическими тестами являются молекулярногенетические и цитогенетические методы исследования наследственного материала. Например, при СПВ и СА критическим районом служат локусы 15q11.2-q13, а при СБВ - локус 11р15.5. В случае функциональных нарушений с диагностической целью исследуется экспрессия импринтированных генов, и ее результаты строго соотносятся с характером метилирования. При СПВ и СА происходит инактивация генов за счет либо отцовского, либо материнского гиперметилирования двух локусов: D15S63 (ген PW71) и D16S9 (ген ZNF127), а также инактивацияпромоторной области гена SNRPN. При СБВ гиперметилирование касается импринтированных генов IGF2 и LIT1, которые моноаллельноэкспрессируются (метилируются) с отцовского или материнского аллелей.

В основе тестов для диагностики СПВ, СА и СБВ лежит анализ аллельногометилирования критических областей хромосом. Применяются три метода.

•  Анализ аллельногометилирования локусов импринтированных генов. Используя метод, учитывают, что при СПВ независимо от его причины присутствуют только метилированные аллели, а при СА - только неметилированные аллели локусов критических областей хромосом.

•  Бисульфатная модификация ДНК и метилспецифическая ПЦР. Метод основан на модификации геномной ДНК бисульфитомнатрия, позволяющим осуществить химическое превращение неметилированных остатков цитозина в урацил, в то время как 5-метилцитозин остается неизменным. По измененному нуклеотидному составу судят о состоянии метилирования каждого цитозинового остатка на исследуемом фрагменте ДНК. В частности, при СПВ образуется продукт той длины, которая соответствует метилированномуматеринскомуаллелю, а при СА обнаруживается неметилированный отцовский аллель. Для анализа применяется набор из трех праймеров (общий, материнский и отцовский). Материнский и отцовский праймеры попарно с общим праймером дают продукты амплификации, равные 313 и 221 н.п. соответственно. Разновидностью этого метода является МС-ПЦР, используемая для скрининговой диагностики СПВ и СА, но без определения их генетических причин. Анализ микросателлитного полиморфизма локусов критического района 15q11.2-q13. Метод позволяет идентифицировать делеции и ОРД на основе анализа микросателлитного полиморфизма в локусах D15S11 (входит в область наименьшего перекрывания всех делеций при СПВ), D15S113 (расположен внутри области перекрывания всех делеций при СА) и GABRB3 (характеризуется большим количеством аллелей и гетерозиготностью). Обычно формируются делеции стандартной протяженности (4 млнн.п.), перекрывающие все три локуса. Анализ этих трех локусов можно проводить методом мультиплексной ПЦР с тремя парами праймеров. При отсутствии делеций и ОРД при диагнозе СПВ и СА, подтвержденном на основе анализа метилирования, можно предполагать наличие делеции или мутации в ЦИ. В случае СА (если результат анализа метилирования отрицательный) причиной наследственной природы заболевания может быть мутация в гене-кандидате UBE3A, что имеет большое значение для МГК семьи и прогноза рождения здорового потомства.