2.2 Визначення чутливості до антибіотиків

Метод оснований на здатності антибактеріальних препаратів дифундувати з просочених ними паперових дисків у поживне середовище і пригнічувати ріст мікроорганізмів, посіяних на поверхні агару [7].

Для визначення чутливості диско-дифузійним методом використовували поживне середовище Мюллера-Хінтона. Перед інокуляцією чашки підсушували в термостаті при 35⁰С з привідкритою кришкою протягом 20 хвилин, щоб на внутрішній поверхні кришок не було конденсату рідини. Для визначення чутливості диско-дифузійним методом використовували тільки стандартизовані якісні диски. При визначенні чутливості диско-дифузійним методом використовували інокулюм, що відповідав 0,5 за стандартом Мак-Фарланда, тобто містив приблизно 1,5х10⁸ КУО/см³. Інокулюм використовували для посіву не пізніше 10 хвилин після його приготування [7].

Інокулюм наносили піпеткою на поверхню чашки Петрі з поживним середовищем в об’ємі 1-2 см³, рівномірно розподіляли по поверхні похитуванням, надлишок видалили піпеткою. Привідкриті чашки підсушували при кімнатній температурі протягом 10-15 хв. Потім на поверхню поживного середовища нанесли диски з антибактеріальними препаратами. Відстань від диска до краю чашки і між дисками має бути 15-20 мм, тобто на одну чашку діаметром 100мм поміщали не більше 6 дисків з антибактеріальними препаратами. Відразу після закінчення аплікації дисків чашки Петрі поміщали до термостату догори дном і інкубували при температурі 35⁰С протягом 18-24годин (час залежить від виду досліджуваного мікроорганізму). Після інкубації чашки поміщали догори дном на темну матову поверхню так, щоб світло падало на них під кутом 45⁰ (облік у відбитому світлі). Діаметр зон затримки росту вимірювали з точністю до 1 мм[7].

При вимірюванні зон затримки росту орієнтувались на зону повного пригнічення видимого росту. Не звертаючи при цьому увагу на дуже дрібні колонії, які виявлялися в межах зони затримки росту тільки за особливих умов освітлення або збільшення , і ледь помітний наліт біля краю зони. Крупні колонії в межах чіткої зони пригнічення росту свідчили про наявність сторонньої мікрофлори або про гетерорезистентність популяції мікроорганізмів, в цьому випадку необхідно було повторити ідентифікацію мікроорганізму, що формував цю колонію, і визначення чутливості цього штаму.

При визначенні чутливості диско-дифузійним методом штамів протеїв, що рояться, зона пригнічення росту могла бути затягнутою тонкою вуалеподібною плівкою, яка не заважала встановленню межі зони і не враховувалась при реєстрації результатів[7].

Контроль якості визначення чутливості з використанням набору контрольних штамів проводили щоразу паралельно з тестуванням клінічних ізолятів. Проте, при отриманні досить стабільних результатів контролю якості протягом одного місяця, частота контрольних досліджень скорочується до 1-2 разів на тиждень. Контрольні дослідження проводили при використанні нових партій реагентів, перш за все поживного середовища. Якщо при проведенні подібного тестування одержані результати виходили за межі вказаних норм , необхідно було повернутись до щоденного контролю якості для з’сування причин отримання неправильних результатів.

Контороль чистоти росту культури проводили таким чином – інокулюм, використаний для оцінки чутливості, засівали на чашку з неселективним поживним середовищем та інкубували протягом 16-24 годин. При виявленні на неселективному середовищі змішаної культури результати оцінки антибіотикочутливості не враховували, дослідження повторювали.

Кожна нова партія поживних середовищ перевірялась на придатність для росту досліджуваних організмів. Для цього використовували відповідні контрольні штами: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcua aureus, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae та інші.

Для цього з цих культур готували суспензію густиною 0,5 за стандартом МакФарланда, використовували добові культури вказаних мікроорганізмів, з якої готували серію послідовних розведень 1: 10. Потім на приготовані чашки з відповідним поживним середовищем висівали по 0,1 см³ суспензії 10^-5, 10 ^-6,10 ^-7розведень, що містило відповідно 1х10³, 1х10², 1х10¹КУО/см³. При хороших поживних властивостях середовища повинен виявлятися ріст мікроорганізмів 3 10^-6, 10^-7 розведень[7].

Для контролю стерильності проводили інкубацію при 35⁰С протягом 24 годин репрезентативної кількості чашок з агаром з кожної партії при визначенні чутливості диско-дифузійни методом.

Для достовірних результатів визначення чутливості велике значення має рН середовища. Для визначення рН під час перевірки середовища ми використовували рН-метр з поверхнево-активним електродом.

Для отримання точних результатів визначення чутливості до антибіотиків (особливо до аміноглікозідів, фторхінолонів, карбопенемів, тетрацикліну та деяких інших) поживне середовище повинне містити сурово стандартизовані концентрації двовалентних катіонів, перш за все Ca²⁺ і Mg²⁺. Їх міст ми визначали за допомогою результатів тестування чутливості контрольного штаму Pseudomonas aeruginosa до аміноглікозідів – діаметр зони навкруги диска з гентаміцином був в межах 16-21 мм, а МІК гентаміцину – в межах 0,5-2,0 мкг/см³. Отриманні данні дали змогу зробити висновок що перевіряєме поживне середовище придатне для роботи[7].

Результати контролю заносили до журналу.

Для визначення чутливості грибів роду Candida до антибіотиків було використане середовище Сабуро. Готували інокулюм з концентрацією 0,5 за стандартом МакФарланда, який містив приблизно 1,5х10⁸ КУО/см³. Інокулюм використовували для посіву не пізніше 10 хвилин після його приготування [7].

Інокулюм наносили піпеткою на поверхню чашки Петрі з поживним середовищем Сабуро в об’ємі 1-2 см³, рівномірно розподіляли по поверхні похитуванням, надлишок видалили піпеткою. Привідкриті чашки підсушували при кімнатній температурі протягом 10-15 хв. Потім на поверхню поживного середовища наносили диски з протигрибковими препаратами. Відстань від диска до краю чашки і між дисками складала не менше 15-20 мм. Чашки Петрі поміщали до холодильника. Чашки на котрих були нанесені диски з інтраконазолом, флуконазолом поміщали в холодильник на 1 годину, чашки на котрих були нанесені диски з ністатином та клотримазолом поміщали до холодильника на 2 години. По закінченю терміну інкубації чашки з посівами перенесли до термостату, інкубували при 27⁰С протягом 40-48 годин. По закінченню терміну інкубації оцінювали зони затримки росту та дані заносили до журналу.